Постоянный препарат изучен на малом увеличении. Практикум по цитологии растений - Паушева З.П

М.: Агропромиздат, 1988. - 271 c.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка): praktiumpocitologii1988.djvu Предыдущая 1 .. 57 > .. >> Следующая
Постоянный микротомный препарат с продольными срезами корней сначала рассматривают при малом увеличении микроскопа. На кончике корня хорошо заметен чехлик, предохраняющий конус нарастания от повреждений во время роста
в почве. Далее следует конус нарастания корня, или зона деления клеток (около 2 мм). За конусом нарастания расположена зона растяжения, где клетки вытягиваются в длину, а затем зона всасывания с корневыми волосками. Митоз изучают на меристематических клетках конуса нарастания корня, где имеется много делящихся клеток. Меристема состоит из рядов клеток прямоугольной формы. Каждый ряд клеток ведет свое происхождение от одной клетки.
После ознакомления с корнем при малом увеличении препарат нужно рассматривать с объективом 40X.
Интерфаза. На обычных постоянных препаратах интерфазное состояние ядра характеризуется нежной структурой хроматина. Хромосомы в это время сильно деспирализованы и не выявляются. Ядра имеют округлую форму и гомогенную зернистую структуру. Из других компонентов ядра хорошо видны ядрышки. При использовании некоторых ядерных фиксаторов, например Бродского, и окрашивании препаратов гематоксилином можно увидеть с иммерсией под микроскопом (объектив 90Х) в ядре растительной клетки хроматиновую сеть и крупные зерна хроматина, образующие хромоцентры.
После завершения интерфазы клетки вступают в митоз. Деление клетки обычно начинается с преобразований в ядре.
В профазе (рис. 47) ядро увеличивается, и в нем становятся отчетливо видны хромосомные нити, которые в это
Рис. 47. Митоз в клетках корня лука Allium сера (микро-томный препарат):
1 профаза; "2 - метафаза; Я - анафаза;. 4 - тело фаза; 5 - интерфаза.
время уже спирализованы. Каждая хромосома после удвоения в интерфазе состоит из двух сестринских хроматид, соединенных одной центромерой. В конце профазы обычно исчезают ядерная оболочка "и ядрышки. На препаратах всегда можно найти раннюю и позднюю профазы и сравнить их между собой. Хромосомные нити более четко видны в поздней профазе, и нередко можно заметить, что они удвоены.
Метафаза, После того как исчезнет ядерная оболочка, видно, что хромосомы достигли максимальной конденсации, стали короче и перемещаются к экватору клетки, располагаясь в одной плоскости. Этот период в митозе называется метафазой. Клетка уже имеет митотическое (ахроматиновое) веретено, состоящее из опорных и тянущих нитей. Первые из них протянуты от одного полюса к другому, а вторые связывают центромеры хромосом с полюсами.
На препаратах, окрашенных гематоксилином, нити митотического веретена не всегда видны, так как данный краситель ядерный. Однако в учебном фильме и на других препаратах хорошо видно, что каждая хромосома, будучи -прикрепленной к митотическому веретену, состоит из двух параллельно расположенных хроматид.
Удвоенная хромосома в метафазе обычно располагается перпендикулярно нитям митотического веретена и на равном расстоянии от полюсов. Центромеры всех хромосом находятся в одной экваториальной плоскости, что очень удобно для подсчета хромосом и изучения их морфологии. "
Микротомные препараты для подсчета хромосом обычно делают с поперечных срезов корней, чтобы метафаза была видна с полюса. В таком положении хорошо видно, что хромосомы располагаются на некотором расстоянии друг от друга. В это время их можно зарисовать и подсчитать.
Анафаза начинается с момента деления центромер, а затем происходит разъединение хроматид. Сестринские хрома-тиды каждой хромосомы расходятся к разным полюсам. Так происходит точное распределение генетического материала, и на каждом полюсе оказывается такое же число хромосом, какое было у исходной клетки до их удвоения. Например, у ржи в соматических клетках 14 хромосом. В метафазе у нее
14 удвоенных (дихроматидных) " хромосом. В анафазе после расхождения сестринских хроматид на полюсах оказывается снова по 14 хромосом.
После разделения центромеры каждая хроматида приобретает функции самостоятельной хромосомы.
Перемещение хроматид к полюсам происходит вследствие сокращения тянущих нитей и удлинения опорных нитей митотического веретена. При просмотре учебного фильма видно, что этот процесс совершается очень быстро по сравнению" с дру-
гими фазами и его труднее уловить. Поэтому на препаратах анафаза встречается реже, чем профаза.
В телофазе хромосомы на каждом полюсе претерпевают’деконденсацию, т. е. процесс, противоположный происходящему в профазе. Контуры хромосом теряют свою четкость, митотическое веретено разрушается, восстанавливается ядер-ная оболочка и появляются ядрышки. Таким образом, после различных структурных преобразований произошло разделение неходкого ядра на два дочерних. Во время телофазы из фраг-мопласта формируется клеточная стенка, которая делит все содержимое цитоплазмы на две равные части, - происходит цитокинез. Так заканчивается митоз.
О продолжительности отдельных фаз митоза можно судить по прижизненным наблюдениям. Установлено, что в эндосперме гороха профаза длится 40 мин, метафаза - 20, анафаза-12, телофаза-1.10 мин, т. е. наиболее продолжительны оказываются первая и последняя фазы митоза. Весь митоз длится около 3 ч. Продолжительность митотического цикла - в несколько раз больше. Так, у конских бобов (Vicia fab а) весь митотический цикл длится 30 ч, причем митоз составляет 4 ч, а интерфаза - 26 ч, из которых период G\ - 12 ч, S - 6 ч, С2 - 8 ч. У скерды зеленой самый короткий митотический цикл в некоторых клетках длится 8 ч, а большинство клеток проходит его за 10-12 ч. Из трех периодов интерфазы наиболее вариабелен по продолжительности Gi-период. Кинетика митоза зависит от различных внутренних и внешних факторов, уровня илоидности, pH среды, гормональной активности, температуры, режима освещения и др.

Биологические объекты можно исследовать как живыми, так и фиксированными. В последнем случае для более тщательного изучения материал можно разделить на части и обработать различными красителями, чтобы выявить и идентифицировать те или иные структуры. Из исследуемого объекта можно приготовить временные или постоянные препараты.

Фиксация препаратов

Фиксация - это сохранение материала в состоянии, близком к естественному. Для этого необходимо быстро умертвить ткани, что лучше всего достигается с небольшими кусочками живого материала. Используемое для этого вещество называется фиксатором. Быстрой фиксацией достигается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что с них можно готовить тонкие срезы.

Обезвоживание препаратов

Обезвоживание проводится при подготовке материала к заливке или для заключения его в соответствующую среду, которая не смешивается с водой. Воду необходимо удалить также потому, что иначе препарат будет со временем разрушен бактериями. Для того чтобы сохранить ультраструктуру, обезвоживание надо проводить постепенно, обрабатывая материал рядом водных растворов этанола или про-панона (ацетона) со все возрастающей концентрацией, и закончить обработку «абсолютным» (безводным) этанолом или пропаноном.

Просветление препаратов

Некоторые из общеупотребительных сред для заливки и заключения не смешиваются со спиртом . Поэтому его надо постепенно замещать средой (просветляющим веществом), с которой заливочная среда смешивается, например ксилолом. Это приводит также к тому, что материал становится прозрачным.

Заливка препаратов

Для того чтобы с помощью микротома получить очень тонкий срез, необходимо, чтобы материал был залит в соответствующую опорную среду . При приготовлении препаратов для световой микроскопии объекты заливают в парафин, которому затем дают остыть. Для электронной микроскопии приходится использовать более твердые вещества (пластмассы или смолы), поскольку здесь необходимы особо тонкие срезы, а значит, и опора должна быть более плотной.

Изготовление срезов препаратов

Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе срезы должны быть толщиной 8-12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани.

Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20-100 нм) для электронного микроскопа. В этом случае необходим алмазный или стеклянный нож.

Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном и, следовательно, в твердом состоянии.

Окрашивание препаратов

Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны , поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к различным средствам. Самым распространенным является окрашивание. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в таблице.

Определенные красители в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живого материала. Их называют прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся, например, метиленовый синий и нейтральный красный.

При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез перед окрашиванием частично обводняют.

Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол; она не пропускает воздух, так что срез может сохраняться в ней неограниченно долго. Заключенный в среду срез накрывают покровным стеклом.

Последовательность описанных выше действий типична, когда речь идет о приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:

а) если срез сырого материала готовят вручную, то сначала делают срез, а потом его фиксируют;

б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо его стадии. Например, красителем, растворенным в 50%-ном этаноле, можно окрасить срез после его обезвоживания в 50%-ном этаноле.

В микроскопе для получения увеличенного изображения очень мелких объектов используется увеличительная способность выпуклых линз. На рис. П.2.3 изображен микроскоп с указанием деталей его строения. Микроскоп-дорогой прибор, поэтому необходимо обращаться с ним осторожно и не пренебрегать следующими правилами:

1. Храните микроскоп в ящике (или под колпаком), чтобы предохранить его от пыли.

2. Вынимайте его из ящика двумя руками и ставьте на место мягко, чтобы избежать сотрясения.

3. Линзы должны быть чистыми, для этого их необходимо протирать кусочком ткани.

4. Микроскоп всегда необходимо фокусировать, перемещая трубу вверх от препарата. В противном случае очень легко повредить препарат.

5. Держите открытыми оба глаза и смотрите ими по очереди.

Настройка микроскопа для работы при малом увеличении

1. Поставьте микроскоп на стол и сядьте в удобной позе. Исследуемый объект на предметном столике микроскопа должен быть освещен. Для этого пользуются специальным осветителем, светом из окна или от настольной лампы. В двух последних случаях используют вогнутую поверхность находящегося под предметным столиком зеркала. С помощью зеркала свет направляют через отверстие в предметном столике. Если имеется подходящий конденсор, то для направления света через него используют плоскую поверхность зеркала.

2. С помощью винта грубой настройки поднимите вверх тубус микроскопа и поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив с малым увеличением (× 10 или 16 мм) не попадет в паз тубуса (при этом раздается щелчок).

3. Положите препарат, который вы собираетесь рассматривать, на предметный столик микроскопа так, чтобы находящийся под покровным стеклом исследуемый материал находился над серединой отверстия в предметном столике.

4. Глядя на предметный столик и препарат сбоку, опускайте тубус с помощью винта грубой настройки до тех пор, пока объектив с малым увеличением не окажется примерно в 5 мм от препарата.

5. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус.

Настройка микроскопа для работы при большом увеличении

1. При работе с объективом большого увеличения для создания достаточного освещения необходим искусственный свет. Для этого используют настольную лампу или специальный осветитель для микроскопа с матовой лампочкой. При работе с лампой накаливания необходимо между ней и микроскопом поместить лист бумаги. Поверните зеркало плоской поверхностью вверх так, чтобы свет, отражаясь, попадал в микроскоп.

2. Сфокусируйте конденсор, не убирая препарата с предметного столика. Поднимите конденсор так, чтобы расстояние между ним и предметным столиком было не более 5 мм. Глядя в микроскоп, поворачивайте винт грубой настройки до тех пор, пока объект не попадет в фокус. Теперь наводите фокус конденсора до тех пор, пока изображение лампы не наложится точно на препарат. Поместите конденсор несколько вне фокуса так, чтобы изображение лампы исчезло. Теперь освещение должно быть оптимальным. В конденсор вмонтирована диафрагма. Ею регулируют величину отверстия, через которое проходит свет. Это отверстие должно быть открыто как можно шире. Таким образом достигается максимальная четкость изображения (см. рис. П.2.3).

3. Поворачивайте револьверную головку до тех пор, пока объектив большого увеличения (× 40 или 4 мм) не попадет в паз. Если на малом увеличении фокус уже был установлен, то при повороте револьверной головки объектив большого увеличения автоматически установится приблизительно в фокусе. Фокусирование всегда производите движением объектива вверх с помощью винта тонкой настройки.

4. Если при движении объектива с линзами большого увеличения фокус не устанавливается, сделайте следующее: глядя на предметный столик сбоку, опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока линза почти не коснется препарата. Следите за отражением линзы объектива на препарате и добивайтесь того, чтобы линза почти коснулась своего отражения.

5. Глядя в микроскоп и поворачивая винт тонкой настройки, медленно поднимайте объектив до тех пор, пока изображение не попадет в фокус.

Увеличение

Увеличение объекта под микроскопом происходит с помощью окуляра и линзы объектива (табл. П.2.1).

Масляная иммерсия

Для того чтобы получить более сильное увеличение, чем при работе с обычным объективом большого увеличения, необходимо использовать масляно-иммерсионную линзу. Способность линзы собирать свет в значительной степени усиливается, если между линзой объектива и покровным стеклом поместить жидкость. Жидкость должна иметь тот же коэффициент преломления, что и сама линза. Поэтому в качестве жидкости обычно используют кедровое масло.

1. Положите препарат на предметный столик и сфокусируйте изображение так же, как при работе с обычным большим увеличением. Вместо объектива с линзой большого увеличения установите объектив с масляно-иммерсионной линзой.

2. Капните каплю кедрового масла на покровное стекло непосредственно над исследуемым объектом.

3. Снова сфокусируйте изображение теперь уже под малым увеличением, затем поворотом револьверной головки установите объектив с масляно-иммерсионной линзой так, чтобы его кончик касался капли масла.

4. Глядя в микроскоп, очень осторожно сфокусируйте линзу с помощью винта тонкой настройки. Помните, что фокусная плоскость линзы находится всего в 1 мм от поверхности покровного стекла.

5. Кончив работу, сотрите с линзы масло мягкой тряпочкой.

1. Установка микроскопа на рабочем месте является важным условием успешной работы. Микроскоп следует поставить, ориен­тируя его для наблюдения левым глазом, на расстоянии около 3 см от края стола.

2. Перед работой необходимо протереть все внешние части микро­скопа, не вынимая окуляр.

3. Для обеспечения максимального движения предметного столика (и препарата) перед началом работы с микроскопом следует центрировать предметный столик, т.е. движением винтов привести его в положение,

при котором линза конденсора располагается точно посередине отвер­стия предметного столика. Центрировать предметный столик нужно и в процессе работы, и после ее окончания.

4. Освещение поля зрения проводится следующим образом. При изучении зоологических подвижных объектов лучше использовать вогнутое зеркало, предварительно подняв конденсор вверх до упора. Наилучшее освещение дает рассеянный дневной свет, но можно ис­пользовать и другие источники света. Следует помнить, что нежела­тельно слишком яркое и с бликами освещение поля зрения, беспокоящее живые объекты и опасное для зрения исследователя. Поле зрения долж­но быть освещено равномерно. При обнаружении в нем темных зон следует проверить положение револьвера и частей конденсора. При изучении прозрачных или бесцветных объектов поле зрения следует притенить, прикрыв диафрагму или опустив конденсор. При рассмо­трении темных, интенсивно окрашенных объектов, диафрагму нуж­но открыть.

5. Фокусировка изображения. Используя постоянный или изго­товив временный препарат, помещают его на предметный столик.

Начинать работу нужно с изучения объекта при малом увеличе­нии, поэтому, приступая к работе и закончив ее, следует поставить микроскоп на малое увеличение. Понять необходимость выпол­нения этого требования можно, если наблюдать изменения расстояния между нижним концом объектива и препаратом при повороте револь­вера и смене объектива малого увеличения (10 х или 15 х) на большое (40 х). Исходное положение объектива малого увеличения ~1 см от ниж­него его края до препарата.

Исследуя объект, основную информацию о нем можно получить при малом его увеличении, при котором оптимальны освещенность и резкость. Переходя на большое увеличение, мы выигрываем в разме­рах объекта, но значительно проигрываем в четкости общей картины.

При малом увеличении фокусировка (наведение на резкость) осу­ществляется с помощью макровинта под постоянным контролем глаза, т.е. не отнимая глаза от окуляра. Добившись необходимой резкости (грубая наводка макровинтом), окончательную доводку фокусировки выполняют микровинтом. При хорошей грубой наводке движение микровинта в одну или другую сторону (от себя или к себе) не должно превышать двух полных оборотов. В противном случае следует снова использовать макровинт. Это особенно важно при работе с большим увеличением, когда расстояние от края объектива до препарата очень

18 Технические средства изучения микроскопических объектов

Микроскоп бинокулярный стереоскопический (МБС) 19

мало. При большом увеличении следует пользоваться только микро­винтом, предварительно проведя грубую наводку при малом увели­чении, а затем поворотом револьвера установив большое увеличение. Закончив изучение препарата при большом увеличении, микроскоп следует сразу перевести на малое увеличение.

При работе с объективами разного увеличения нужно помнить два важных обстоятельства.

Во-первых, микроскоп дает плоскостное изображение объекта. Поэтому при большом увеличении мы видим четко очень тонкую плоскость, все, что выше или ниже ее, видно неясно, и нужно посто­янно работать микровинтом, чтобы рассмотреть все структуры. При объективе малого увеличения исследуемая плоскость толще и часто позволяет отчетливо видеть весь объект.

Вторая особенность работы при разных увеличениях связана с освещением. Маленькое входное отверстие и свойства линз объек­тива большого увеличения пропускают очень узкий пучок световых лучей, поэтому при переходе с малого на большое увеличение мы зна­чительно теряем в интенсивности освещения объекта. Необходимо открыть диафрагму конденсора.

6. Перемещение препарата на предметном столике при малом увели­чении осуществляется вручную. Определенную трудность представляет то, что оптическая система микроскопа дает обратное изображение. Нужна определенная сноровка, чтобы усвоить: все, что мы видим сверху, на са­мом деле расположено внизу, то, что справа, - находится слева, и нао­борот.

При переходе на большое увеличение движение препарата долж­но быть очень точным и проводится винтами предметного столика. Переходя с малого на большое увеличение, объект или его часть, ко­торую нужно изучить, необходимо предварительно движением пре­парата разместить в центре поля зрения малого увеличения и лишь после этого перевести на большое увеличение.

Микроскоп, как всякий точный прибор, требует бережного обра­щения. Протирать его, особенно линзы окуляра и объектива, изготов­ленные из мягкого, легко повреждаемого стекла, нужно осторожно, используя мягкие, много раз стиранные сухие полотняные салфетки. Нельзя использовать для очистки стекол спирт, т.к. это вызывает рас­творение специальных покрытий и помутнение оптики.

Нельзя самостоятельно развинчивать окуляры и объективы. Их повреждения может устранить только специалист.

Микроскоп бинокулярный стереоскопический (МБС)

Для изучения объемных организмов и наблюдения за движени­ем, питанием и другими формами поведения достаточно крупных (не микроскопических) животных, а также для их препарирования используются бинокулярные стереоскопические микроскопы малого увеличения (МБС). Они дают прямое изображение, имеют большое поле зрения, широкий диапазон разрешающих увеличений (табл. 2). С помощью МБС можно изучать прозрачные водные объекты в про­ходящем световом потоке и непрозрачные, темные - в отраженном свете. В настоящее время используются модели МБС-9 и МБС-10 (рис. 3).

Таблица 2 Кратность увеличения объектов бинокулярным микроскопом при использовании разных объективов и окуляров

Оптический блок МБС включает оптическую головку и окуляр­ную насадку.

В оптическую головку вмонтированы все оптические детали, включающие объектив микроскопа, выше которого установлен барабан с галилеевскими системами. Ось барабана заканчивается расположен­ными снаружи с двух сторон рукоятками, при вращении которых происходит переключение увеличений, значения которых нанесены на рукоятках (7 х, 4 х, 2 х, I х, 0,6 х).

Чтобы установить нужное увеличение, необходимо, вращая ба­рабан, цифру на рукоятке совместить с точкой на подшипнике. При этом перефокусировку проводить не нужно. Положение барабана фиксируется щелчком. Фокусировка объектива оптической головки производится винтами на направляющей, с помощью которых поднимают или опускают головку относительно столика микроскопа.

20 Технические средства изучения микроскопических объектов

Окулярная насадка состоит из двух призм, заключенных в по­движные оправы, на которых укреплены окулярные трубки. Двигая оп-швы призм, можно менять расстояние между центрами линз окулярных tdv6ok адаптируя их положение к межзрачковому расстоянию глаз исследователя.

Предметный столик съемный, устанавливается и закрепля­ется винтом на специальном основании. На задней стенке основания столика имеется гнездо для осветителя. Внутри основания располо­жено зеркало с матовой и зеркальной поверхностями и рукояткой для его вращения при регулировании освещения поля зрения.

Осветительная система, помимо зеркала, включает специальный осветитель, состоящий из конденсора и лампы накаливания, объе­диненных общим корпусом.

Изучение объекта возможно в отраженном и проходящем свете. Что­бы использовать осветитель для работы в отраженном свете, его крепят на шарнирном кронштейне. Для наблюдения в проходящем свете осветитель переносится в гнездо основания предметного столика.

В зависимости от структурных особенностей объекта (его плот­ности, прозрачности, окраски) отверстие предметного столика может закрываться стеклянной или металлической пластинкой, одна сторо­на которой окрашена в белый, другая - в черный цвет.

Изготовление препаратов для микроскопирования

Для изучения под микроскопом используют заранее изготовлен­ные постоянные препараты (их изготовление требует определен­ных навыков и времени) либо по ходу работы готовятся временные препараты. Материалом для них могут служить целые микроскопи­ческие или достаточно мелкие объекты (тотальные препараты) или части их тела.

При работе с микроскопом любой объект помещается на пред­метное стекло - стеклянную пластинку стандартного размера (76 х 26 мм). Очень немногие объекты рассматриваются сухими, чаще в капле воды или другой жидкости. Чтобы предохранить стекла объек­тивов от увлажнения, помещенный на предметное стекло в капле жидкости материал покрывается покровным стеклом. Его обычный размер 18 х 18 мм. Оно изготавливается из высококачественного сте­кла, очень тонкое и хрупкое.

Технические средства изучения микроскопических объектов

Покрывать каплю жидкости с исследуемым материалом нужно так, чтобы на препарате не остава­лись пузырьки воздуха. Для этого, держа покровное стекло за два угол­ка, противоположную его грань ста­вят в каплю жидкости и постепенно опускают стекло (рис. 4). Оставши­еся пузырьки легко отличить: они имеют широкий темный ободок, а поверхность их отливает зеркаль­ным блеском. Крупные пузырьки также имеют темное окаймление, а внутренняя их поверхность напо­минает запотевшее стекло.

Покрывая подготовленный временный препарат покровным стек­лом, необходимо учитывать объем изучаемого объекта, в противном случае он может быть деформирован или раздавлен тяжестью стекла. Во избежание этого на покровное стекло наносят восковые ножки. Обычный чистый пчелиный воск смешивается со скипидаром при подогреве (и тщательном соблюдении правил противопожарной бе­зопасности!) в пропорции 2,5:1. Такая масса может длительное время храниться, лучше в стеклянном бюксе или коробке. Перед исполь­зованием воск слегка разминают пальцами, чтобы он стал пластич­нее. Затем все четыре уголка покровного стекла, слегка царапая ими по комочку, снабжают восковыми ножками желаемой высоты и по­крывают объект на препарате, ориентируя покровное стекло ножками вниз.

Подцарство Protozoa - простейшие Тип Sarcomastigophora - саркомастигофоры

Тип объединяет более 25 000 видов простейших. Знакомству с его представителями в лабораторном практикуме по зоологии беспозво­ночных уделяется значительное внимание. В частности, предусмат­ривается ознакомление студентов с простейшими, принадлежащими к трем наиболее значимым подтипам: саркодовых, жгутиконосцев и опалинат.

Подтип Sarcodina - саркодовые

Изучение животных традиционно начинается с одноклеточных, а среди последних - с саркодовых. Наиболее удобным объектом явля­ется группа пресноводных амеб. Они малоподвижны, имеют доста­точно простое строение и легко культивируются в лабораторных усло­виях. Все это облегчает их изучение.

Представители подтипа в большинстве своем характеризуются амебоидным движением. Обитают в водной среде, почве, имеются па­разитические формы.

Надкласс Rhizopoda - корненожки

Объединяет организмы с псевдоподиями, не имеющими высоко-дифференцированных внутренних скелетных образований.

Класс Lobosea

Амебоидные формы с лопастевидными псевдоподиями (лобопо-диями), для которых не характерно слияние в сетевидные структуры.

Развивающийся макрогамнт крупнее шизонта, имеет округлую форму и одно ядро, расположенное в центре клетки. В цитоплазме этой стадии находятся гранулы с тенкообразующего вещества. Расположение гранул различно у макрогамонтов разного возраста: у более молодых они расположены равномерно по всей цитоплазме, у более поздних расположены кольцом вокруг ядра. Макрогамета отличается от макрогамонта овальной формой и периферическим расположением гранул. Сформированная ооциста характеризуется овальной формой и наличием защитной оболочки желтого или коричневого цвета.

Аннотация к рисунку 5.4.5. Для кровяных споровиков характерно наличие в жизненном цикле двух хозяев - кровососущих комаров и теплокровных позвоночных. В организме комаров происходит половой процесс и спорогония, в организме позвоночных - бесполый процесс. Агамное размножение в организме позвоночного включает два этапа: экзоэритроцитарная шизогония и эндоэритроцитарная шизогония. Объектом изучения являются эндоэритроцитарные стадии жизненного цикла кровяных споровиков. Для изучения студенту предоставляетеся мазок крови человека, зараженного малярией. В связи с ликвидацией малирии как массового заболевания все имеющиеся на кафедре зоологии ЮФУ препараты являются старыми, и количество их ограничено, вследствие этого знакомство с препаратми производится на демонстрационном МИКРОСКОПЕ (используется большое увеличение). В эритроцитах можно обнаружить разные стадии трофозоитов и шизонтов. Наиболее молодые стадии имеют очень типичную форму кольца, кольцо имеет диаметр, равный приблизительно 1/3 диаметра эрироцита (от ¼ до ½). В стенке кольца находится единственное ядро. На более поздних стадиях размер плазмодия увеличивается, а форма его становится неправильной, за счет формирования пседоподий (в этот период плазмодий активно движется внутри эритроцита). Позднее в цитоплазме шизонта накапливаются гранулы коричневого пигмента, а в цитоплазме пораженного эритроцита появляются мелкие красные гранулы. Еще позднее шизонт принимает правильную округлую форму, ядро его делится, образуя от 12 до 24 ядер.

Теоретические задания к занятию 5.4:

1. Дать определения понятиям спорозоит, шизонт, мерозоит, гамонт.

2. Дать определение понятию спорогония.

3. Расположить последовательно, в нужном порядке стадии жизненного цикла споровиков: гамета, спорозоит, шизонт, мерозоит, зигота, гамонт, эти стадии соединить стрелками, над которыми написать название процесса, приводящего к формированию следующей стадии.

4. Определить значение в жизненном цикле спорозоитов и мерозоитов.

В руководстве И.Х.Шаровой надотряды инфузорий не приводятся, отряд Гименостомат считается относящимся к подклассу Равноресничных инфузорий Holotricha.

Аннотация к заданию 7.5 по изучению инфузорий. Инфузории представляют собой наиболее высоко организованных простейших, для которых характерны многочисленные апоморфные признаки: наличие ресничек, наличите кортекса, ядерный дуализм, конъюгация и другие. Главным объектом изучения является классический объект - инфузория-туфелька. Изучение инфузорий ведется под малым и большим увеличением МИКРОСКОПА, некоторые детали строения демонстрируются на демонстрационном микроскопе. Инфузории-туфельки сравнительно крупные простейшшие, их длина составляет 180-280 мкм.

Кроме изучения внешнего вида, инфузории на этом занятии подвергаются воздействию разных реактивов для выявления различных клеточных структур. Выполнение каждого такого опыта завершается рисунком контура тела инфузории, в который врисовывается обнаруженная структура, т.е. каждый рисунок снабжается только одним обозначением (например, при выявлении ресничек обозначаются только реснички и т.п.).

Для изучения инфузорий готовится временный препарат, для чего на предметное стекло наносится капелька культуральной жидкости с инфузориями. Капельку накрывают покровным стеклом, при этом покровное стекло сначала подносят к краю капли, держа его в наклонном положении, ждут, пока капля не растечется по краю покровного стекла, а затем отпускают. Такой порядок работы обеспечивает отсутствие на препарате пузырьков воздуза.

Рассматривиют изготовленный временный препарат при малом увеличении микроскопа. Плывущая инфузория вращается вокруг продольной оси, поэтому поворачивается к наблюдателю разными сторонами. По одной из сторон тела, условно называемой вентральной (брюшной), лежит широкая борозда - перистом. На дне перистома расположен цитостом (клеточный рот). Следует отметить, что цитостом (как и описанный ранее ультрацитостом споровиков) не является отверстием - в этой зоне покровные элементы представлены только плазмалеммой, так что только в этой зоне возможно впячивание поверхностной мембраны вглубь цитоплазмы, то есть формирование пищеварительной вакуоли. Работа завершается рисунком, изображающим несколько инфузорий в разных положениях.

Для изучения других особенностей организации инфузорий следует остановить. Для этого к двум противоположным краям покровного стекла прикладываются две полоски фильтровальной бумаги. Вода при этом отсасывается из-под стекла, количество жидкости между предметным и покровным стеклом уменьшается, и инфузории оказываются прижатыми к стеклу, но живыми. Примечание: если будет удалено слишком большое количество воды, инфузории будут раздавлены, в этом случае работу необходимо повторить. Даже при удачном проведении опыта количество воды под покровным стеклом вследстиве испарения постепенно убывает, так что инфузории в конце концов все равно гибнут, признаком повреждения инфузории является появление пузырей по краям ее тела.

На обездвиженной инфузории следует рассмотреть положение и устройство сократительных вакуолей, определить время промежутка между двумя пульсациями вакуоли. Следует также более детально рассмотреть строение тела инфузорий. Для оптимизации работы ниже приводится более подробное описание строения тела парамеций.

Инфузория-туфелька имеет вытянутое асимметричное тело. Передний конец в целом более узок и плавно закруглен. По направлению к заднему концу тело расширяется, максимальная ширина тела - в задней трети. Самый задний участок тела резко сужается, так что задний конец кажется заостренным. Может быть, не лишним будет заметить, что очертания тела инфузории действительно сходны с дамской туфелькой, точнее, со следом туфли, но передним концом инфузории является "пятка туфли", а задним - соответственно "носок туфли". Тело снаружи одето пелликулой (строение пелликулы и кортекса более подробно описано в соответствующих статьях "глоссария"), которую наблюдатель отмечает как наружную границу клетки.

Вся поверхность тела равномерно покрыта ресничками. Без специальных приемов микроскопирования или окрашивания реснички неразличимы, кроме более длинного пучка ресничек на самом заднем конце тела (caudatum означает "хвостатая"). По контуру клетки, однако, можно рассмотреть движение воды, вызванное биением ресничек.

Как и других простейших, цитоплазмаинфузорий подразделяется на эктоплазмуи эндоплазму. Ранее упомянутые трихоцистынаходятся в эктоплазме. На интактной инфузории отдельные трихоцисты не видны, но заметна легкая исчерченность эктоплазмы, вызванная присутствием трихоцистов.

В эндоплазме содержится большое количество разнообразных включений, за счет чего она кажется зернистой. В эндоплазме же располагаются и основные органоиды.

Собственно цитостом на живых клетках не виден, иногда удается наблюдать процесс формирования пищеварительной вакуоли. Пищеварительные вакуоли в большом числе находятся в эндоплазме. Они хорошо заметны у обездвиженных инфузорий. Представление о пищеварительных вакуолях дополняется рассмотрением постоянного препарата (см. ниже). Пищеварительные вакуоли проделывают по эндоплазме путь по определенной траектории и в конце концов опорожняются через цитопрокт. Этот органоид рассмотреть на временных препаратах не удается.

Для инфузории-туфельки характерно наличие двух сократительных вакуолей, расположенных в предней и задней части клетки. Комплекс каждой вакуоли включает резервуар сократительной вакуолии приводящие каналы, их количество - 5-7. На остановленных инфузориях удается наблюдать работу сократительной вакуоли: сначала заполняются каналы, затем жидкость поступает в резервуар, при этом каналы спадаются. Затем следует опорожненение резервуара, и цикл начнется сначала. Передняя и задняя сократительные вакуоли работают в противофазе. Эту особенность следует отразить в рисунке.

Как уже укасзывалось, ядерный аппарат инфузорий представлен макро- и микронуклеусом. На интактной инфузории ядра не видны, как более светлое пятнышко может просвечиваться место расположения макронуклеуса. Результатом изучения обездвиженной инфузории является рисунок, на котором будут нарисованы и обозначены все обнаруженные органоиды.

Для обнаружения ресничек на инфузорий воздействуют йодной настойкой. Для этого на предметное стекло помещается капля настоя с инфузориями. Затем к этой капле добавляется небольшая капля йодной настойки. Смесь накрывается покровным стеклом и микроскопируется. Под действием йодной настойки инфузории гибнут, их цитоплазма окрашиваеться в бурый цвет, а на краю тела обнаруживаются короткие реснички.

Трихоцисты у интактной инфузории не видны. Эти органоиды обнаруживаются, если на инфузорию воздействовать химическими агентами. Технология воздействия не отличается от работы, описанной для обнаружения ресничек. Для воздействия на инфузорий можно использовать раствор уксусной кислоты, раствор пикриновой кислоты, жидкость Гелея. В любом случае инфузории выбрасывают трихоцисты. При этом трихоцисты разворачиваются в длинные упругие нити. Обычно такие нити хорошо видны на переднем и заднем конце тела, но могут быть обнаружены и в других зонах.

Для обнаружения ядра на инфузорий (по уже описанной технологии) воздействуют слабым раствором уксусной кислоты, к которому добавлена краска (метиленовая синь или метилиновая зелень). Иногда ядро обнаруживается и при воздействии фиксатора Гелея. Как правило, после воздействия тем или иным реактивом удается обнаружить только макронуклеус, который лежит в средней части эндоплазмы. В очень редких случаях рядом с макронуклеусом обнаруживается и микронуклеус.

Пищеварительные вакуоли наиболее четко обнаруживаются на постоянном препарате, в котором заключены инфузории, предварительно накормленные красителем конго-рот. В эндоплазме каждой инфузории обнаружавается около полутора десятков ярко-красных пищеварительных вакуолей. Этот препарат выставляется на демонстрационном микроскопе. Результаты изучения этого препарата могут быть отражены в отдельном рисунке или пищеварительные вакуоли могут врисованы в изображение обездвиженной инфузории.

С инфузориями легко проводится опыт по обнаружению отрицательного хемотаксиса, то есть реакции избегания тех или иных веществ. Для этого на предметное стекло помещают капельку настоя с инфузориями и неподалеку от нее (5-10 мм) - капельку чистой воды. Две капли соединяют узким водным протоком, но не покрывают покровным стеклом. Изготовленная система просматривается под микроскопом, при этом обнаруживается, что инфузории находятся только в капле родного настоя. На следующем этапе на краю капли настоя помещают кристаллик поваренной соли и вновь просматривают под микроскопом. Обнаруживается, что под воздействием соли инфузории в массе (кроме погибших) устремляются по водному протоку в соседнюю каплю. Результаты работы отражаются двумя полусхематическими рисунками, на первом все инфузории (которых можно изобразить в виде небольших палочек) находятся в капле настоя, на втором - к капле настоя пририсовывается кристаллик соли, а инфузории изображаются в водном протоке и в другой капле (погибших инфузорий можно не изображать).

При работе по этой теме в капле воды, кроме инфузорий-туфелек, могут быть обнаружены и другие виды инфузорий. Чаще всего могут быть встречены стилонихии (Stylonichia) и сувойки (Vorticella). Стилонихии по длине очень близки к инфузориям-туфелькам, но тело их более широкое. Стилонихии большую часть времени проводят на поверхности субстрата. Реснички на "брюшной" стороне тела склеены в пучки - цирры, и стилонихии при передвижении опираются на эти пучки. Сувойки ведут прикрепленный образ жизни. Их тело похоже на колокольчик, сидящий на длинном стебельке. Этим стебельком сувойки прикрепляются к субстрату. Стебелек сократим: под микроскопом легко наблюдать, как при сокращении стебелька (он при этом скручивается штопором) тело сувойки прижимается к субстрату, а потом медленно распрямляется. Реснички у сувоек располагаются только на вершине колоколообразного тела, по периферии окружая перистом. При обнаружении этих (или других) видов инфузорий следует понаблюдать за ними, отметив перечисленные выше характерные особенности. Изображения их не выполняются.

Теоретическое задание к занятию 5.5:

Составить таблицу, в которой в сравнительном аспекте характеризуются признаки конъюгации и копуляции.

Сравнительная характеристика конъюгации и копуляции

Аннотация к рисунку 5.6.1. Губки представляют собой очень примитивных многоклеточных животных, ведущих только прикрепленный образ жизни. Клетки губок дифференцированы, но не образуют настоящих тканей. Эти животные не имеют мышечной и нервной систем. Очень характерным признаком губок является наличие скелета. Большая часть губок (около 90%) относится к классу Обыкновенные губки, представители которого и рассматриваются на лабораторном занятии. Представители этого класса во взрослом состоянии имеют лейконоидный тип организации. Скелет представлен кремневыми одноосными или четырехосными спикулами. У ряда видов спикулярный скелет сочетается со спонгиновым, а у некоторых - представлен только органическим спонгином. Мезохил развит хорошо. Знакомство с губками начинается с изучения внешнего вида трех представителей, относящихся к различныям жизненным формам: одиночная губка, колониальная кустистая губка, колониальная губка, имеющая форму нароста. Отметим, что для изучения предоставляются высушенные экземпляры, сохранившие только скелет. Как уже указывалось, одиночные губки имеет форму бокала с единственным отверстием, обращенным в толщу воды - оскулюмом. Предлагаемый студентам для изучения экземпляр (Rossela sp.) имеет форму усеченного конуса высотой около 35 см. Из основания этой губки торчат многочисленные игловидные спикулы. Эти спикулы в естественных условиях погружены в ил (губка живет на глубинах несколько сотен метров) и обеспечивают закрепление животного на субстрате. Примечание: как игловидные спикулы, так и спикулы собственно тела, - острые, губку Rossela sp. не рекомендуется трогать руками. Для обеспечения целостности прикрепительных игловидных спикул губка сохраняется в перевернутом положении, однако на рисунке следует изобразить ее в естественном положении. Губка Lubomirskia baikalensis является колониальной. Колония имеет кустистую форму, отдельные ветви соотвествуют отдельным особям. На поверхности этой губки хорошо видны поры. Оскулюмы этих губок плохо различимы. Колониальные губки могут также иметь форму наростов, располагающихся на различных подводных предметах. Из числа таких губок студентам демонстрируется губка Euspongia officinalis, у этой губки оскулюмы различимы хорошо.

Аннотация к рисунку 5.6.2. Изучение спикул производится на постоянных препаратах, под малым увеличением МИКРОСКОПА. Студентам предоставляются препараты одноосных и четырехосных спикул. Одноосные спикулы имеют вид палочек, чаще всего веретеновидных, сужающихся к обоим концам. Четырехосные спикулы содержат три луча, лежащих в одной плоскости и сходящихся в одной точке, при этом лучи сужаются к концам. Четвертый луч расположен перпендикулярно к трем остальным и выходит из той же центральной точки. Если смотреть на спикулу сверху, то этот четвертый луч виден только как точка (и тогда спикула выглядит как фирменный знак автомобилей марки "мерседес"), при всех других положениях можно рассмотреть все четыре луча. Спикулы, как уже указывалось, состоят из кремнезема, они сильно преломляют свет и под микроскопом выглядят как сделанные из стекла.

Аннотация к рисунку 5.6.3. Студентам для изучения предоставляется постоянный препарат, на котором размещен тонкий срез губки Geodia. Изучение ведется под малым увеличением МИКРОСКОПА. На поверхности губок этого вида размещается совокупность спикул различных типов. Таким образом, изучение этого среза демонстрирует возможность существования в одном организме разнокачественных спикул. Самую наружную часть коркового слоя образуют многочисленные одноосные спикулы, имеющие вид коротких заостренных палочек. Глубже них располагаюется корковый слой, состоящий из сферических спикул - сферастеров. Под корковым слоем залегают четырехосные спикулы (тетраксоны). Тетракосны Geodia имеют три коротких луча. Эти лучи плотно прилежат к корковому слою. Четвертый луч в 8 – 10 раз длиннее остальных и расположен перпендикулярно к поверхности губки, в мезохиле. В мезохиле могут быть обнаружены небольшие звездчатые микросклеры. Нередко на препарате тетраксоны оказываются поломанными, на рисунке, естественно, рекомендуется показать их целыми.

Аннотация к рисунку 5.6.4. У части представителей класса Обыкновенных губок, как уже указывалось ранее, минеральный скелет дополняется органическим скелетом, состоящим из специфического вещества - спонгина. Спонгин выделяется совокупностью клеток спонгиобластов, причем нити спонгина выделяются из тела клеток, формируя единую для всего организма сеть. Некоторые представители этого класса вообще утратили минеральные спикулы, так что их скелет предстапвлен только сетью волокон спонгина (именно эти губки издавна использовались человеком для мытья тела).

Для изучения студенту представляется постоянный препарат, на котором помещен фрагмент спонгинового скелета Euspongia officinalis. Изучение проводится под малым увеличением МИКРОСКОПА. При выполнении этого рисунка студент должен добиваться сходства изображения с реальным участком скелета, который имеет вид сети с неправильными ячейками.

Аннотация к рисункам 5.6.5 и 5.6.6. Для многих видов пресноводных губок, обитающих в умеренных широтах, характерно внутреннее почкование, или геммулогенез. Этот процесс происходит осенью и обеспечивает переживание губками неблагоприятных условий. Суть геммулогенеза заключается в том, что в мезохиле материнской особи образуется скопление археоцитов (амебоцитов). Археоциты (амебоциты), расположенные внутри геммулы, несут запас питательных веществ. Археоциты (амебоциты) наружного слоя запаса веществ не несут, они формируют внутреннюю часть стенки геммулы. Затем в стенку встраиваются склеробласты, несущие амфидиски, причем склеробласты быстро погибают. Амфидиски представляют собой особые спикулы, имеющие форму стержня, на обоих концах которого имеются дисковидные пластинки с неправильно изрезанными краями (изолированный амфидиск, лежащий на боку, больше всего похож на катушку). Амфидиски армируют стенку геммулы.Под микроскопом при рассмотрении сбоку они видны как совокупность стерженьков, расположенных внутри стенки геммулы, перпендикулярно к ее поверхности; при рассммотрении сверху обнаруживается зведчатые диски. Археоциты (амебоциты) затем выделяют еще средний и наружный слои стенки геммулы. На одном полюсе стенка геммулы остается однослойной, этот участок носит название порового отверстия или микропиле.Весной на месте микропиле прорывается отверстие, через которое археоциты (амебоциты) выходят наружу, чтобы дать начало новой губке.

Студентам для работы предоставляется 2 постоянных препарата:

1) геммула пресноводных бадяг; 2) амфидиски геммул. Первый из препаратов изучается под малым увеличением МИКРОСКОПА, второй - под малым и большим увеличением. В результете изучения первого из препаратов студент изображает характерную форму геммул, поровое отверстие и слой амфидисков внутри двойной оболочки. Результатом изучения второго препарата является изображение изолированного амфидиска, который следует избразить в двух проекциях - вид сверху и вид сбоку.

Теоретические задания к занятию 5.6:

1. Составить таблицу, в левом столбце которой приводится название клеточных элементов тела губок, в среднем столбце - название клеточного слоя, котором они расположены, (здесь же можно привести изображение этого типа клеток), в правом столбце - приводятся сведения о функциях клеток этого типа.

2. Привести схему (рисунок), изображающую процесс оплодотворения у губок. Дать определение этому типу оплодотворения.

3. Определить значение геммул в жизни губок. Определить роль амфидисков в структуре геммулы.

В руководстве И.Х.Шаровой латинская терминология полностью совпадает с приведенной, но подкласс Hydroidea получает русское название Гидроиды, а отряд Hydrida - Гидры.

Аннотация к рисунку 5.7.1. Кишечнополостные являются водными животными, большинство из них ведет сидячий образ жизни. Строение их тела характеризуется радиальной симметрией. В составе тела выделяются два клеточных пласта. Жизненные форма кишечнополостных представлены либо полипами либо медузами. По особенностям организации выделяют три класса кишечнополостных. Изучение этой группы животных начинается с класса Гидрозои, а именно с пресановодной гидры.Студентам демонстрируют внешний вид гидры (на живом объекте или на постоянном препарате), изучение проводится под БИНОКУЛЯРОМ, лучше с объективом х2. Настоятельно не рекомендуется проверять способность гидр к сокращению тела, трогая ее пальцем, карандашом, или другим предметом, этот "опыт" может повредить гидре.

Гидра является одиночным полипом, размер ее составляет 1.0 - 1.5 сантиметров, не считая длины щупалец. Количество щупалец не фиксировано строго, чаще всего их 5 - 6, но встречаются гидры и с большим количеством щупалец. На аборальном полюсе находится подошва, которой животное прикрепляется к субстрату. На оральном полюсе находится венчик щупалец, этот венчик окружает так называемый гипостом, т.е. конусовидную верхнюю часть тела. На вершине гипостома находится рот. Считается, что рот у гидры при каждом приеме пищи прорывается заново, после приема пищи края рта смыкаются, и клетки даже соединяются десмосомами, так что рассмотреть рот не удается. Остальная часть тела гидры называется стебельком. Если имеется выраженное расширение тела (и гастральной полости) в верхней части тела, то оно именуется желудком.