Выход бактерий из персистирующего состояния. Регенерация клеточной стенки и реверсия к клеточным формам

Персистенция От лат. persisto - постоянно пребывать, оставаться, длительное существование, присутствие длительное пребывание инфекта в организме животных и человека либо без клинических патологических проявлений (латентное течение, ремиссия инфекционного процесса), либо способных при определенных условиях (иммунный дисбаланс и иммунная недостаточность различной этиологии - стресс, переохлаждение, интеркуррентная инфекция, обстрение хронического заболевания и т. д.) к активации с исходом в заболевание (активное течение, обострение инфекционного процесса).

Механизмы персистенции: - Образование L-форм Антигенная мимикрия Иммуноглобулиновый покров Способность секретировать вещества, препятствующие действию иммунных факторов Сорбция белков хозяина на поверхности клетки и экранирование от иммунной системы хозяина Антифагоцитарные факторы: Капсулы Микрокапсулы Слизистые чехлы Вещества снижающие хемотаксис Незавершенный фагоцитоз и др

Действие бактерий на цитокины: Действие Разрушают цитокины Бактерии Н. aeruginosa с помощью ферментов L. pneumophila Связывают цитокины Е. coli Подавляют синтез Цитокинов Цитокины ИЛ-2, ФНОа, ИФ-у ИЛ-2 ИЛ-1, ИЛ-2, ФНОа, ГМКСФ S. typhimurium, S. flexneri ФНОа M. tuberculosis ТРФ(3 M. avium ИЛ-6 L. monocytogenes ИЛ-3, КСФ-1 E. coli ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФ-у Y. enterocolitica, B. suis, V. ФНОа cholerae, B. anthracis P. aeruginosa ФНОа, ИЛ-1, ИФ-у S. typhimurium ИЛ-2

Антилизоцимная и антилактоферриновая активность: Микроорганизмы n Антилактоферриновая активность, Антилизоцимная нг/мл активность, мкг/мл M ± SD S. aureus S. haemolyticus S. epidermidis E. coli Klebsiella spp. 15 22, 72 ± 1, 88 10, 1 ± 2, 17* 16 20, 08 ± 1, 41 4, 40 ± 1, 12 15 11, 50 ± 1, 45* 9, 91 ± 0, 82* 16 22, 84 ± 1, 41 4, 19 ± 0, 61 12 7, 83 ± 1, 13* 8, 92 ± 2, 45* 15 5, 65 ± 0, 62 1, 24 ± 0, 25 12 23, 87 ± 0, 67* 2, 58 ± 0, 27* 12 18, 17 ± 3, 20 1, 64 ± 0, 15 12 19, 40 ± 2, 47 3, 24 ± 0, 27* 14 18, 13 ± 0, 64 1, 83 ± 0, 28 Больные ревматическими заболеваниями Контроль *Статистически достоверно

Образование L-формы - бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. К возникновению L- форм приводит воздействие агентов, блокирующих выработку клеточной стенки: 1. антибиотики (пенициллины циклосерин, цефалоспорины, ванкомицин), 2. ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза), 3. ультрафиолетовые и рентгеновские лучи, 4. аминокислота глицин.

История вопроса: Буква L - первая буква названия Листеровского института в Лондоне, где впервые доктор наук Эмми Кляйнебергер-Нобель в 1935 году обратила внимание на развитие морфологически весьма необычных клеток в культуре бактерий Streptobacillus moniliformis, выделенной из жидкости уха крысы.

вакуоли L-форма Bacillus subtilis, масштаб - 500 нм. Многообразие L-форм Bacillus subtilis, при масштабе в 10 мкм.

L-формы Особенности L- форм: 1. Синтез полноценной клеточной стенки невозможен Возвращение в вегетативную форму при нормализации факторов окружающей среды Возвращение в вегетативную форму невозможно. Дальнейшее существование как у микоплазм Сходные культуральные свойства. 3. Постепенное превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры. Образование стабильных и нестабильных Lформ. 5. Изменение антигенных свойств (утрата К- и Оантигенов). Приобретение способности к персистенции. 6. Снижение вирулентности в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п) стабильные Система генетического контроля синтеза клеточной стенки (пептидогликан) 2. 4. нестабильные Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

Механизм фагоцитоза: Хемостаксис Силы физико-химического взаимодействия Градиент концентрации 2. Стадия адгезии Осонизация (АТ, С 3 b, фибронектин, сурфактан) Физико-химическое взаимодействие 3. Эндоцитоз 4. Микробоцидность Кислороднезависимая кислородзависимая

макроорганизм 1. Нарушение слияния фагосомы с лизосомой (микобактерии туберкулеза, простейшие, токсоплазмы) 2. Резистентность к лизосомальным ферментам (гонококки, стрептококки гр А, микобактерии, ерсинии) 3. Длительная персистенция в цитоплазме (хламидии, риккетсии) микроорганизм

Механизм персистенции хламидий Типичные включения, содержащие элементарные и ретикулярные тельца 48 часов после инкубации Патоморфологическая модель персистенции. После перенесенного теплового шока во Включениях меньших размеров содержатся крупные патологические формы хламидий

Макрофаг не презентирует основной АГ (MOMP) Экспрессия ранних Генных продуктов лизосома Антигенная перегрузка Гиперпродукция Ig A, G ГЗТ Антигенная мимикрия Сфингомиелинсодержащие экзоцитозные пузырьки, КГ hps 60 - белки теплового шока Липополисахарид. Не экспрессируется Состояние между Ретикулярными и Элементарными тельцами MOMP- не экспрессируется

+ Антифагоцитарная активность: 1. Плотная клеточная стенка элементарных телец (дисульфидные связи между структурами белка MOMP) 2. Прочность ретикулярных телец (полисахаридная капсула) «несостоятельность» Респираторного взрыва Активация СПОЛ и повреждение Мембран собственных клеток

ФНОα γИФ ИЛ-1 1. Усиление экспрессии АГ Клеточных мембран (ГКС, Fc) Активация фибробластов И эпителиальных клеток (непрофессиональные фагоциты) 2. Стимуляция ИЛ 1 и ИЛ 2 3. Активация фагоцитарной акт 4. Стимуляция выработки Ig 5. Индукция свободных радикалов

Медиаторы персистенции Chlamydia trachomatis Медиатор Эффект Низкие концентрации g -интерферона Резкое снижение количества эндогенного триптофана (активация фермента индоламин -2, 3 -диоксигеназы, расщепляющего триптофан до N-формилкинуренина) ФНО-a Дефицит эндогенного триптофана Опосредованный, путем активации b -ИФ (блокирует репродукцию внутриклеточных микроорганизмов, путем усиления экспрессии мембранных белков клеток) Необходим для построения МОМР Дефицит ц. ГМФ и высокое количество ц. АМФ Отсутствие активации ферментов необходимых для дифференциации РТ в ЭТ Дефицит и/или действие антагонистов Са 2+ Нарушение агрегации эндосомальных вакуолей

Медиаторы персистенции Chlamydia trachomatis (продолжение) L-изолейцин Эффект возможно обусловлен включением продукта метаболизма a -метилбутарила. Со. А в синтез жирных кислот С. trachomatis с последующим встраиванием "чужих" триглицеридов в клеточную мембрану, приводя к ее дестабилизации Дефицит цистеина Незаменима аминокислота, контролирующая дифференциацию РТ в ЭТ (включается в 3 важнейших для дифференциации белка), уменьшение числа дисульфидных мостиков факторов прочности клеточной стенки.

«Генетический дрейф» , или антигенная мимикрия: Аминокислотная последовательностиь 264 -286 главного сигма-фактора РНК-полимеразы хламидий (Chl. trachomatis). L 7 (пептид II), один из рибосомальных белков АТ Ревматические аутоиммунные заболевания

Персистенция Francisella tularensis цитохолазин-Внечувствительный путь Каспазы 3 и 9 TNF, IL 1 23 -k. Da эндосомы

+Антилизоцимная Антилактоферриновая Антикомплиментарная Активность ЛПС francisella tularentis S-ЛПС R-ЛПС Остаточная вирулентность вирулентные Низкая Чувствительность хозяина LPS-binding protein – LBP Инертный ЛПС Быстрая элиминация Высокая Чувствительность хозяина Гибель организма персистенция

Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках: Устойчивость биопленок к внешним воздействи ям характеризуют термином “персистенция” (от англ. persistence – выносливость, живучесть). Мертвые клетки

Значение персистенции в биопленках По данным Центра контроля заболеваний (CDC USA), около 65% всех инфекций обусловлено формированием в макроорганизме биопленок Образование биопленок на всех вводимых в макроорганизм медицинских устройствах (катеторы, протезы, стенты и тд); Образование биопленок на медицинском инструментарии…

бактерия + dna. J (синтез шаперона) у. E. coli pmr. C (синтез фосфолипидов) у. S. typhimurium Неблагоприятные условия Экспрессия SOS-генов Ген rmf, ингибитор трансляции Гены теплового и холодового шока rec. A, umu. DC, uvr. AB, sul. A Клетки-персистеры htr. A, htp. X, csp. H, clp. B, cbp. AB Гены системы «токсинантитоксин» din. J/yaf. Q, yef. M, rel. BE, maz. EF

Ген А Ген Т Ген Р антибиотик антитоксин рибосома Дефектный белок Нормальный белок Комплекс Т-А Нет синтеза белка персистенция

Основные токсины и место их приложения у E. Coli: токсин мишень активность Процесс Ccd B ДНК-гираза Двухцепочечные разрывы Репликация Rel E Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция Maz F РНК Эндорибонуклеаза Трансляция Par E ДНК-гираза Двухцепочечные разрывы Репликация Doc Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция Vap C РНК Эндорибонуклеаза Неизвестно Ξ-токсин Неизвестно Фосфотрансфераза Неизвестно Hip A EF-TU Протеинкиназа Трансляция Hip B Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция

Сигма-фактор РНК-полимеразы Rpo. S Адаптивный мутагенез: ? “Адаптивными” называют мутации, которые возникают в медленно размножающейся или покоящейся популяции микроорганизма в период продолжительного стресса и которые противодействуют причинам, вызывающим данный стресс. Veillonella parvula Streptococcus mutans Устойчивость к антибиотикам

Lewis K. 2008 год считает, что главным способом борьбы с персистенцией в биопленках является «рассеянность пациентов» …

Персистирующая инфекция – это заболевание, которое вызывается бактериями, обитающими в человеческом организме. Некоторые из них не представляют угрозы для здоровья, но другие – несут постоянную угрозу, а потому защитные механизмы организма тщательно контролируют их размножение. Длительное пребывание таких «спящих» агентов – это и есть причина болезни.

Что это за инфекции?

Механизм, который запускает развитие или активацию персистирующей инфекции, напрямую зависит от состояния здоровья человека – от того, насколько его организм силен, чтобы блокировать скрытую инфекцию.

Под влиянием внешних факторов, персистирующая инфекция может выходить и проявляться клинически. К таким факторам можно отнести:

• снижение иммунитета (дополнительно читайте, );
• сильный стресс;
• переохлаждение;
• снижение защитных функций организма на фоне другого заболевания.

Возбудители инфекции

Не все микроорганизмы способны существовать в организме человека и при этом «не выдавать себя». Вирусы, которые могут персистировать, обязательно должны обладать таким свойством, как внутриклеточное существование в микроорганизме. В число таких агентов входят:

• хламидии;
• микоплазмы;
• хеликобактер;
• вирусы группы герпесвируса;
• гепатит;
• токсоплазмы.

В группе риска хронической персистирующей инфекции находятся следующие лица:

• доноры крови;
• недоношенные дети;
• беременные;
• онкобольные;
• медицинский персонал;
• пациенты с иммунодефицитом.

Течение острых инфекций отличается от течения инфекционных процессов, которые вызывают персистирующие вирусы. Например, если острая инфекция (грипп, корь и т. д.) проявляет себя сразу же, то персистирующие инфекции протекают хронически с возможными вспышками паталогических процессов. Так, у персистирующих инфекций есть две формы – латентная (ремиссия) и обостренная (когда вирус активируется).

Воспалительный процесс, который вызывает персистирующая инфекция, приводит к изменениям во всех системах организма: морфологическим, метаболическим, структурным. Это отражается на органах и их работе.

• болезненное мочеиспускание;
• учащенное мочеиспускание;
• мутный цвет мочи или же наличие в ней кровяных сгустков или гноя.

• озноб;
• лихорадку;
• слабость и боль в мышцах (вплоть до полной невозможности встать с постели);
• увеличение селезенки;
• спутанность сознания.

Важно понимать, что по таким признакам сложно поставить точный диагноз, а саму скрытую инфекцию можно и вовсе упустить из виду.

Диагностика и лечение

• цистоскопическое исследование биологического материала (соскоб из уретры, исследования мочи и слюны) – позволяет обнаружить характерные клетки персистирующего вируса;
• молекулярно-биологическая диагностика – помогает выявить вирусный ДНК геном;
• иммуноферментный анализ – помогает обнаружить специфические антитела.

• Терапию противовирусными препаратами (Фоскарнет, Ганцикловир).
• Терапия иммунными средствами. Она нужна потому, что часто персистирующая инфекция переходит в острую форму на фоне иммунодефицита.

Персистирующая инфекция – очень сложная патология, которая у каждого пациента протекает индивидуально, поэтому важен такой подход в лечении, который основан на состоянии здоровья пациента и его общей истории болезни.

Особенности инфекции у детей

Дети могут «подхватить» персистирующую инфекцию двумя способами:

• от другого больного человека или животного, при контакте с инфекционной средой;
• из внешней среды, так как детский организм никак не препятствует вирусу, который свободно входит в благоприятную среду и там размножается.

• жар (температура от 38 до 40 градусов);
• непрекращающаяся головная боль;
• вялость;
• отсутствие аппетита;
• сильное потоотделение;
• боль в мышцах;
• тошнота и рвота.

• лихорадка;
• охриплость или полная потеря голоса;
• кашель;
• заложенность носа и выделение гноя из пазух.

• придерживаться меню, обогащенного фруктами, овощами и молочными продуктами;
• постараться сбить температуру – малышам до года можно поставить свечку, а малышам старше года можно дать Ибупрофен для детей.

Полностью или частично утратившие клеточную стенку или предшественников ее биосинтеза, растущие в виде характерных мелких колоний. Впервые открыты в 1935 г. Клинебергер (E. Klieneberger) в культуре Streptobacillus moniliformis, выделенной К. Левадити с сотр. в 1932 г. из суставной жидкости больного эпидемической суставной эритемой. Streptobacillus moniliformis - грамотрицательная, гемоглобинофильная палочка с четковидными вздутиями на концах, хорошо растущая на кровяном (10-20%) агаре и свернутой сыворотке.

При изучении экспериментальной инфекции у крыс Клинебергер выделила несколько штаммов, содержащих, помимо типичных бактериальных форм, полиморфные микроорганизмы, весьма сходные по виду колоний и морфологии с плевропневмониеподобными организмами - pleuropneumoniae like organism (P PL О). Эти микроорганизмы были названы в честь Ин-та им. Листера - L-формой.

В течение многих лет Клинебергер рассматривала L-формы как представителей PPLO-симбионтов бактерий Streptobacillus moniliformis. Доказательством симбиотического существования двух разных микроорганизмов являлось отсутствие реверсии бактерий из L-форм на протяжении 13 лет (350 пересевов).

Разнообразные эксперименты амер. исследователя Дайнеса (L. Dienes) и др. доказали ошибочность концепции Клинебергер. Было показано, что L-формы Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus и других бактерий способны реверсировать в исходный вид бактерий. Образование L-форм бактерий описано под названиями «L-трансформация», «L-конверсия», «индукция L-форм».

В. Д. Тимаковым и Г. Я. Каган были получены L-формы многих видов бактерий, изучены их биол, свойства и роль в патологии (ревмокардит, септический эндокардит, менингоэнцефалит, хрон, гонорея и др.).

Превращение в L-форму - свойство, по всей вероятности, присущее всем бактериям. Препараты, оказывающие L-трансформирующее действие, либо блокируют определенные звенья биосинтеза клеточных стенок, преимущественно пептидогликана (муреина), либо их разрушают. К препаратам, индуцирующим L-формы бактерий, относят: 1) антибиотики соответствующего спектра действия, напр, пенициллин, циклосерин, лизостафин и др.; 2) муролитические ферменты - лизоцим, эндоацетилгексозаминидазу фагоассоциированного лизина стрептококка группы С и др.; 3) нек-рые аминокислоты (глицин и др.).

Индукция L-форм бактерий зависит от условий и сред культивирования: необходимо создание физ.-хим. окружения, способствующего стабилизации осмотически хрупкой мембраны бактерий и предохраняющего L-формы от гибели.

Состав среды и условия культивирования варьируют в зависимости от вида бактерий, обязательны полутвердая и полужидкая концентрация агарового геля, присутствие нормальной лошадиной сыворотки и подбор осмотической концентрации солей, способствующих сохранению целостности цитоплазматической мембраны L-форм бактерий.

Различают нестабильные и стабильные L-формы бактерий. Нестабильные формы сохраняют нек-рые элементы клеточной стенки или ее предшественников и при пассажах на средах без L-индуцирующего агента реверсируют в исходный вид бактерий. Стабильные формы полностью утрачивают компоненты клеточной стенки и не способны ее восстановить, поэтому они не реверсируют в исходный вид бактерий, даже при многократном пассировании на средах без индуцирующего агента, а также на средах, содержащих сукцинат натрия или желатину, способствующих реверсии бактерий из L-форм.

L-формы бактерий растут в виде двух типов колоний - А. и В. Колонии типа А чаще присущи стабильным L-формам бактерий, они очень мелкие (50-100 мкм), врастают в агар, хорошо растут группами, единичные колонии часто не дают роста. Минимальные репродуцирующиеся элементы колоний типа А, полностью лишенные клеточной стенки, не имеют фаговосприимчивых рецепторов. Колонии типа В чаще присущи нестабильным L-формам бактерий, они более крупные, размером 0,5-2 мм, с нежным кружевным краем и врастающим в среду центром. В колониях преобладают шаровидные тела разной оптической плотности; субмикроскопических элементов в них меньше, чем в колониях типа А. Они сохраняют нек-рые элементы клеточной стенки, фаговосприимчивые рецепторы и могут агглютинироваться сывороткой исходного вида.

Дифференциация колоний на типы А и В условна, так же как и явление стабилизации L-форм. В культурах стабильных L-форм бактерий могут содержаться, колонии типа В, а в культурах нестабильных L-форм- колонии типа А.

В составе колоний L-форм бактерий содержатся: 1) сферические тела разной оптической плотности и размеров; 2) элементарные тельца или гранулы, располагающиеся группами, а также интрацеллюлярно в более крупных сферических образованиях или вакуолях; 3) плохо контурированные, бесформенные, все время растущие тела; 4) извитые формы; 5) крупные тела с включениями в виде вакуолей. L-формы бактерий отличаются полиморфизмом (рис. 1, 1-6) и вместе с тем принципиально одинаковы у разных видов бактерий/ что не позволяет дифференцировать их по морфол, признаку.

Наряду с утратой клеточной стенки у L-форм бактерий утрачиваются мезосомы, что приводит к непосредственному прикреплению цитоплазматической мембраны к нуклеоиду; восстановления мезосом в процессе реверсии не наблюдается.

Отсутствие клеточной стенки обусловливает дезорганизацию деления и множественность морфол, проявлений при воспроизведении L-форм бактерий. Размножаются L-формы бактерий делением, почкованием или дезинтеграцией клетки на мелкие гранулы.

Физиол., антигенные и патогенные особенности этих форм детерминированы структурой их цитоплазматической мембраны, и, возможно, цитоплазмы.

L-формы бактерий образуются не только in vitro, но и in vivo, они могут сохраняться в организме и реверсировать в исходную бактериальную форму.

На рисунке 2 приведены результаты получения L-форм S. typhi in vivo под влиянием пенициллина. Бактерии и антибиотик вводили одновременно интраперитонеально мышам. При введении 100 ЕД пенициллина на 1 г веса образовывались нестабильные L-формы, реверсирующие в исходные бактериальные формы через 24-48 час., к-рые вызывали гибель животных. При введении 2000 ЕД пенициллина на 1 г веса в течение 24-48 час. образовывались стабильные L-формы, подвергавшиеся фагоцитозу; гибели животных в ближайшие 5 сут. не наблюдалось. Аналогичные данные получены при изучении индукции in vivo L-форм других бактерий.

Разработана оригинальная схема выделения L-форм из патол, материала, к-рая позволила выделить и идентифицировать L-формы бактерий из цереброспинальной жидкости больных гнойным менингитом и ревмокардитом.

На рисунке 3 представлены микрофотографии L-форм, выделенных из крови больного ревмокардитом, и их ревертантов, образовавшихся в результате реверсии в стрептококки, впоследствии идентифицированные как Streptococcus hemolyticus группы А.

Антитела к стабильным L-формам Streptococcus hemolyticus обнаружены у 87,9% больных ревматизмом, у 77% больных инфекционно-аллергическим миокардитом и всего лишь у 11% здоровых людей (В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган, 1973). L-формы разных видов бактерий обнаруживаются при хрон, бактериурии, пиелонефритах, абактериальных формах туберкулеза, ревмокардите и др.

Патогенность L-форм бактерий доказана экспериментально, известны хрон, артриты, вызванные интраартикулярным введением L-форм Streptococcus hemolyticus, ангина обезьян, осложненная интерстициальным миокардитом, индуцированная внутривенным введением L-форм Streptococcus hemolyticus, пиелонефриты крыс и кроликов, обусловленные L-формами бактерий рода Proteus и Streptococcus faecalis, менингоэнцефалит кроликов, связанный с L-формами менингококка, и листериоз овец и кроликов, вызванный введением L-форм Listeria monocytogenes. Патол, процессы, обусловленные L-формами бактерий, отличаются постепенным развитием патол. явлений, пролонгированным течением и персистенцией возбудителя в L-форме, поддерживающей переход заболевания в хрон, форму. Персистенция L-форм бактерий установлена экспериментально на L-формах Mycobacterium tuberculosis и Streptococcus hemolyticus.

При однократном внутрибрюшинном заражении белых мышей стабильными L-формами Streptococcus hemolyticus и последующем наблюдении в течение года антиген L-форм сохраняется во всех внутренних органах. На рисунке 4, 1 приведен пример локализации L-форм Streptococcus hemolyticus в селезенке через 3 нед. после инфицирования, на рисунке 4, 2 - через 27 нед. Длительная персистенция L-форм в организме сопровождается нарастанием повреждающего эффекта; развитием интерстициального миокардита и тяжелого гломерулонефрита.

Образование L-форм бактерий in vivo, их связь со многими хронически протекающими процессами, возможность реверсии бактериальных форм с восстановлением их вирулентности и возникновение вследствие этого не поддающихся эффективной терапии рецидивов поставили перед мед. микробиологией проблему изыскания способов борьбы с вариантами микроорганизмов, утратившими клеточную стенку (сферопласты, протопласты, L-формы). Поиски ведутся с двух диаметрально противоположных позиций: 1) предотвращение возможности индукции L-форм in vivo (путь, трудно контролируемый); 2) использование средств, индуцирующих образование L-форм, с последующим применением других препаратов, недейственных в отношении интактных клеток, но проникающих внутриклеточно лишь в L-формы бактерий и разрушающих их. Этот путь наиболее перспективный. Имеются данные об эффективности комбинаций пенициллина и канамицина, используемых для терапии пиелонефритов. Пенициллин индуцирует образование L-форм бактерий, к-рые разрушаются внутриклеточным проникновением канамицина, не действующего на интактные бактерии.

Библиогр.: Пешков М. А. Цитология бактерий, с. 151, М.-Л., 1955; Тимаков В.Д, и Каган Г. Я. L-формы бактерий и семейство mycoplasmataceae в патологии, М., 1973, библиогр.; они же, L-формы бактерий, семейство mycoplasmataceae и проблема микробного персистиро-вания, Журн, микр., эпид, и иммун., № 4, с. 3, 1977, библиогр.; Di enes L. The morphology of the Li of Klieneberger and its relationship to streptobacillus monoli-formis, J. Bact., v. 54, p. 231, 1947; D i e-nes L. a. Weinberger H. The L-forms of bacteria, Bact. Rev., v. 15, p. 245, 1951; Klieneberger E. The natural occurrence of pleuropneumonialike organisms, its apparent symbiosis with streptobacillus moniliformis and the other bacteria, J. Path. Bact., v. 40, p. 93, 1935; K li eneb erger-N obel E. Pleuropneumonia-like organisms (PPLO) mycoplasmataceae, L.- N. Y., 1962; Microbial protoplasts, spheroplasts and L-forms, ed. by L. B. Guze, Baltimore, 1968.

В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган.

Исследование реверсии протопластов бактерий и грибов выявило сходство протекания у них данного процесса. Условно он может быть разделен на три этапа: 1) регенерация клеточной стенки, 2) реверсия, появление клеток-ревертантов, 3) восстановление нормального цитокинеза и появление клеток исходной формы.

Вместе с тем каждой группе микроорганизмов присущи свои особенности протекания реверсии протопластов, связанные со строением клеток и клеточных стенок, характером метаболизма и цитокинеза.

Реверсия бактериальных протопластов . Если при обработке лизоцимом или пенициллином в изотонической среде клеточная стенка с бактериальной клетки полностью не удалена, то при исключении этих агентов из среды происходит быстрое восстановление клеток. Если же клеточная стенка удалена полностью, образовавшийся истинный протопласт неспособен в обычных условиях ее регенерировать. Одним из условий, позволяющих таким формам ревертировать к исходному состоянию, является наличие в среде культивирования твердой или полутвердой основы. Ею может быть желатина (5-30%), агар (0,7-2%), мембранные фильтры, убитые бактериальные клетки или клеточные стенки. Причем использование твердого субстрата предпочтительнее.

Реверсия протопластов мицелиальных грибов . Реверсия к мицелиальным формам у грибных протопластов происходит как в жидкой, так и на поверхности твердой среды, или в слое полужидкого агара. Многие исследователи показали, что реверсия грибных протопластов может проходить тремя способами, различающимися характером формирования первичного мицелия. При первом способе протопласты первоначально образуют цепочку из дрожжеподобных клеток (до 20 клеток). Затем терминальная, уже осмотически устойчивая, продуцирует первичную гифу, образующую мицелий. Второй способ реверсии начинается с регенерации протопластами клеточной стенки, вследствие чего они становятся резистентными к осмотическому шоку. После чего протопласт образует зародышевую трубку. Третий способ реверсии грибных протопластов необычен. Протопласт, сохраняя сферическую форму, формирует новую оболочку в виде полочки, затем туда переносится содержимое материнского протопласта. Если появляется цепочка таких оболочек, то цитоплазма передвигается по этой цепочке, оставляя позади себя "тени" из клеточных стенок. Последняя клетка цепочки образует первичную гифу. Грибные протопласты могут ревертировать одним из трех способов, или у одного вида наблюдается все три способа реверсии. Трудно сказать, что влияет на выбор способа реверсии, возможно, видовые особенности организма, тип его цитокинеза, метод получения и условия инкубации протопластов или состав регенерационной среды.

Растущие и ревертирующие протопласты - хорошая модель для изучения биосинтеза клеточной стенки и взаимоотношений между ростом и ядерным делением клетки.

4.2. Культивирование растительных клеток

Идея возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце XIX века. Период с 1892 по 1902 гг. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. В это время немецкие ученые Х. Фехтинг, К. Рехингер, Г. Габерландт предпринимали попытки выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти первые исследователи, однако высказали ряд идей, реализованных позднее.

В последующие 20 лет были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток. Но в растительном мире каких-либо значительных успехов достигнуть не удалось, не смотря на попытки создания оптимальных питательных сред, способных обеспечивать длительное существование и размножение клеток растений in vitro.

В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений.

В 30-60-е годы, благодаря работе большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и другие), число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, достигло значительного количества (более 150). Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 году целые растения. Значительный вклад в развитие культуры клеток и тканей растений внесли исследования Р. Г. Бутенко и ее сотрудников, использовавших эти методы для изучения физиологии растительных клеток и морфогенеза растений.

В последующие годы были предложены методы получения изолированных протопластов из растительных тканей, найдены условия культивирования, при которых они способны образовывать новую клеточную стенку, делиться и давать начало клеточным линиям. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоля) и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.

В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, методов электрослияния изолированных протопластов и т. д.

Использование методов получения сомаклональных вариантов, экспериментальных гаплоидов, скрининга биохимических мутантов привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.

«Внутренняя среда организма» - В организме человека около 20 литров. Внутренняя среда организма Тканевая Кровь Лимфа (межклеточная) жидкость. Взаимосвязь компонентов внутренней среды организма. Внутренняя среда организма. Внутренняя среда организма – совокупность жидкостей, принимающих участие в процессах обмена веществ и поддержания постоянства внутренней среды.

«Органы организма» - В минуту сердце человека делает в среднем 70 ударов. Бактерии. Какие правила охраны органов чувств «зашифрованы» в рисунках? 3. Какая наука изучает растения? Папоротники. 7. Какой вид растений никогда не цветёт? Лёгкие. Головной мозг. 3 класс "Мы и наше здоровье. Одолела нас дремота, Шевельнуться неохота.

«Биология Иммунитет» - Оборудование: Закрепление знаний. По желанию приготовить сообщение «Из истории переливания крови». Схема «Виды иммунитета». Какие виды иммунитета существуют? Таблица «Кровь», портреты И.И.Мечникова, Л. Пастера. Особенно часто люди бывают носителями туберкулезной палочки. Пассивный. Фагоцитоз Фагоцитоз и выработка антител – единый защитный механизм, названный иммунитетом.

«Пропорции человека» - Данные возрастных изменений пропорций тела у мальчиков: Обычно артериальное давление выше нормы. Брахиморфный тип. Пропорции тела и возраст человека. Сердце расположено поперечно благодаря высоко стоящей диафрагме. Повышен риск артериальной гипотонии. Возрастные изменения пропорций тела. Долихоморфный тип.

«Строение человека» - Как работает наш организм? Опускаем руки мы по команде «два». Итак, мы рассмотрели дом и самолет. Сердце. На зарядку солнышко поднимает нас, поднимайте руки по команде «раз». Без воздуха человек может прожить совсем недолго. Мозг. Переработанная пища попадает в кишечник. Как устроен дом? В чем секрет нашего здоровья?

«Постоянство внутренней среды организма» - Лента из эритроцитов. Белые клетки крови. И.И. Мечников. Плазма крови. Тромбоциты. Кровь. Понятие «внутренняя среда организма». Эритроциты. Гемоглобин. Лейкоциты. Жидкости организма человека. Форменные элементы крови. Протромбин. Микропрепарат крови человека. Тканевая жидкость. Компоненты. Внутренняя среда организма.