Genetik rekombinasyonlar: transdüksiyon, transformasyon, konjugasyon, transpozisyon. Genetik mühendisliği kavramı

Bir matris üzerinde olduğu gibi bir iplikçik üzerine başka bir zincir inşa edildiğinde DNA'nın ikiye katlanması süreciyle tanıştık. Ancak doğada DNA'nın yapısındaki değişikliklerle ilişkili süreçler vardır, ancak bu değişiklikler başka yönlere doğru gider.

dönüşüm– izole edilmiş deoksiribonükleik asit (DNA) kullanılarak genetik bilginin bir hücreye aktarılması. Dönüşüm, dönüştürülmüş hücrede (transformant) ve onun yavrularında, DNA kaynağı olan nesnenin karakteristik yeni özelliklerinin ortaya çıkmasına yol açar. Bu fenomen, 1928 yılında farelere ısıyla öldürülmüş kapsüllenmiş bakteriler ve kapsül içermeyen hücrelerin bir karışımı ile enfekte edildiğinde pnömokoklarda kapsüler polisakarit sentezinin kalıtsal restorasyonunu gözlemleyen İngiliz bilim adamı F. Griffith tarafından keşfedildi. Bu deneylerde fare gövdesi bir tür detektör rolü oynadı, çünkü kapsüler polisakkaritin edinilmesi, kapsül içermeyen hücrelere, hayvan için ölümcül olan bulaşıcı bir sürece neden olma yeteneği kazandırdı. Sonraki deneylerde, öldürülmüş hücreler yerine, yok edilmiş kapsüllenmiş bakterilerden elde edilen bir ekstraktın kapsülden yoksun pnömokoklara eklenmesi durumunda da dönüşümün meydana geldiği tespit edildi. 1944 yılında O. Avery ve meslektaşları (ABD), DNA moleküllerinin dönüşümü sağlayan faktör olduğunu tespit etti. Bu çalışma, DNA'nın kalıtsal bilginin taşıyıcısı olarak rolünü kanıtlayan ilk çalışmadır.

Pnömokoklara ek olarak diğer bazı bakterilerde de dönüşüm keşfedilmiş ve incelenmiştir.

Bakterilerdeki dönüşüm, aşağıdaki aşamaları içeren karmaşık bir süreç olarak kabul edilir:

DNA moleküllerinin alıcı hücre tarafından sabitlenmesi;

DNA'nın hücreye nüfuz etmesi;

Dönüştürücü DNA fragmanlarının konakçı hücre kromozomuna dahil edilmesi;

“Saf” dönüştürülmüş varyantların oluşumu.

DNA fiksasyonu, hücre yüzeyinin (reseptörler) sayısı sınırlı olan özel alanlarında meydana gelir. Reseptörlere bağlanan DNA, ortama eklenen deoksiribonükleaz enziminin etkisine duyarlı kalır ve bu enzimin parçalanmasına neden olur. Ancak fiksasyondan çok kısa bir süre sonra (1 dakika içinde) DNA'nın bir kısmı hücrenin içine nüfuz eder. Aynı suşun bakteriyel hücreleri, DNA'ya karşı geçirgenlikleri bakımından keskin bir şekilde farklılık gösterir. Belirli bir bakteri popülasyonunun yabancı DNA'yı bünyesine katma yeteneğine sahip hücrelerine denir. yetkili . Bir popülasyondaki yetkin hücrelerin sayısı önemsizdir ve bakterilerin genetik özelliklerine ve bakteri kültürünün büyüme evresine bağlıdır. Yeterliliğin gelişimi, DNA'nın hücreye nüfuz etmesini sağlayan özel bir proteinin sentezi ile ilişkilidir.

Bir hücreye giren DNA parçalarının ortalama boyutu 5×106 daltondur. Bu tür parçaların bir kısmı aynı anda yetkin bir hücreye girebildiğinden, emilen DNA'nın toplam miktarı yaklaşık olarak konakçı hücre kromozomunun boyutuna eşit olabilir. Çift sarmallı DNA hücreye nüfuz ettikten sonra, bir sarmal mono ve oligonükleotidlere ayrılır, ikincisi ise kırılmaları ve yeniden birleşmeleri yoluyla konakçı hücre kromozomuna entegre olur. Böyle bir hibrit yapının daha sonra replikasyonu, dahil edilen DNA tarafından kodlanan özelliğin sabitlendiği yavrularda transformantların "saf" klonlarının ayrılmasına yol açar.

Dönüşümün kullanılması gerçekleştirilmeyi mümkün kıldı genetik analiz Başka hiçbir genetik değişim biçiminin (konjugasyon, transdüksiyon) tanımlanmadığı bakteriler. Ayrıca transformasyon, yapısındaki fiziksel veya kimyasal değişikliklerin DNA'nın biyolojik aktivitesi üzerindeki etkilerini belirlemek için uygun bir yöntemdir. Yöntemin geliştirilmesi koli Dönüşüm için yalnızca bakteri kromozomunun parçalarının değil, aynı zamanda bakteriyel plazmitlerin ve bakteriyofajların DNA'sının da kullanılmasını mümkün kıldı. Bu yöntem, genetik mühendisliği araştırmalarında hibrit DNA'nın hücrelere yerleştirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır.

İletim(Latince transductio'dan - hareket) - genetik materyalin bir virüs kullanılarak bir hücreden diğerine aktarılması, bu da alıcı hücrelerin kalıtsal özelliklerinde bir değişikliğe yol açar. Transdüksiyon olgusu, Amerikalı bilim adamları D. Lederberg ve N. Zinder tarafından 1952'de keşfedildi. Özel bakteriyel virüsler - vejetatif üreme sürecinde ılıman fajlar, bakteri DNA'sının herhangi bir bölümünü kazara yakalayıp diğer hücrelere aktarabilir. parçalandı, yani onlar tarafından yok edildi ( genel , veya spesifik olmayan , transdüksiyon). Aktarılan (transdüksiyona tabi tutulan) DNA segmentinin uzunluğu, faj partikülünün protein kabuğunun boyutuna göre belirlenir ve genellikle bakteri genomunun %1-2'sini aşmaz. Aktarılan bölüm birden fazla gen içerebilir. Bu tür bağlantılı transdüksiyonun olasılığı, bakteriyel kromozomu oluşturan DNA molekülündeki genler arasındaki mesafeye bağlı olduğundan, transdüksiyon olgusu, bakteriyel kromozomların genetik haritalarının derlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tür dönüştürücü parçacıklarda fajın genetik materyali yoktur; bu nedenle, DNA'yı hücreye sokarak fajın diğer tüm işlevlerini yerine getirmezler: çoğalmazlar, hücreyi lizojenize etmezler ve ona faja karşı bağışıklık kazandırmazlar. Eklenen parça, hücrede fonksiyonel aktiviteye sahip ek bir genetik eleman formunda mevcut olabilir. Böyle bir parça çoğalma yeteneğine sahip olmadığından, her hücre bölünmesinde yavru hücrelerden yalnızca birine aktarılır. Bu hücre dışında diğer tüm yavruların özellikleri değişmeden kalır ( kürtaj yapan transdüksiyon). Daha sonra parça ya yok edilebilir ya da bakteri kromozomuna dahil edilerek içindeki homolog bir DNA bölgesini değiştirebilir. İkinci durumda, transdüktan hücre tarafından kazanılan yeni özellikler, bu hücrenin tüm yavrularının karakteristik özelliği olacaktır ( tam dolu transdüksiyon).

Lizojenizasyon sırasında faj genomunun bakteri kromozomuna dahil edildiği bölgenin yakınında bulunan yalnızca belirli genleri transdüksiyona tabi tutabilen bir grup bakteriyofaj vardır. sınırlı , veya özel , transdüksiyon). Bakteriyel kromozomdan profaj çıkış sürecinin doğruluğunun rastgele ihlali sonucu oluşan bu tür transdüser faj parçacıkları, faj genomunun geri kalanından ve bakteri genomunun bir fragmanından oluşan bir DNA molekülü içerir. Çoğu durumda, faj genomunun bir kısmının (%30'a kadar) kaybı nedeniyle bağımsız olarak çoğalamazlar veya bakterileri parçalayamazlar. Dönüştürücü parçacıkların genetik materyali hücrede özerk bir durumda kalabilir veya bakteri DNA'sına bir profaj olarak dahil edilebilir. Ancak her iki durumda da profajın kaybı nedeniyle neslin bir kısmı orijinal özelliklerine geri döner. Kararlı transdüksiyon, yalnızca kromozomun homolog bir bölgesinin değişiminin bir sonucu olarak bakteri genomuna profajın bakteriyel bir fragmanının dahil edilmesi durumunda elde edilir.

Epizomlar(epi... ve Yunan soma - vücut) - bir hücrede özerk (sitoplazmada) veya entegre (kromozomda dahil) durumda bulunabilen genetik faktörler; DNA molekülleridir. Epizomlar, ılıman faj lambda genomunu, cinsiyet faktörü F'yi, bakterilere belirli ilaçlara, maddelere ve diğer bazı maddelere karşı direnç kazandıran bazı R faktörlerini içerir. Epizomlar hücrelerin temel bileşenleri değildir ve bir durumdan diğerine değişebilirler. hücre tipine bağlıdır. Örneğin, Escherichia coli hücrelerindeki ılıman faj lambda genomu entegre veya otonom bir durumda olabilir, ancak tifo patojeninin hücrelerinde yalnızca otonom bir durumda olabilir. Otonom bir durumdayken çoğu epizom tipik plazmitler gibi davranır. Bazı yazarlar epizomları kromozomal ve kromozomal olmayan kalıtımı belirleyen yapılar arasındaki geçiş bağlantısı olarak görmektedir.

DNA teşhisi

İnsan vücudu yüzlerce bakteri ve virüs türünün yaşam alanıdır. Biyolojik açıdan bakıldığında, insan vücudu bir arada var olan simbiyotik organizmalardan oluşan bir sistemdir. Ortakyaşarların tümü patojenik değildir. Bazı bakteri türleri olmadan, bir kişi var olamaz; bunların kaybı veya miktarındaki azalma, bir dizi bakterinin gelişmesinin nedenidir. ciddi hastalıklar. Birçok patojenin genomunun tüm proteinlerin tanımlanmasıyla deşifre edilmesi, bulaşıcı hastalıkların önlenmesi ve tedavisine yönelik yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Gelişim için bulaşıcı süreç büyük önem Konağın kendisinin genetik statüsüne sahiptir.Örneğin, bazı kişiler bağışıklık yetersizliği virüsünün taşıyıcılarıdır ancak AIDS hastası değildirler. Bu bireylerde, virüsün lenfoid hücrelere girmesinden sorumlu yüzey proteinini kodlayan gende bir mutasyon vardır. Hücrelerin yüzeyindeki protein yoğunluğu azalır, virüs tutulur ancak içeri girmez. Avrupalılar arasında bu mutasyon için homozigotların sıklığı yaklaşık %1'dir; HIV enfeksiyonlarına karşı belirgin bir dirence sahiptirler. Heterozigot mutasyon taşıyıcılarının da daha dirençli olduğu ortaya çıkıyor; Rus popülasyonunda sıklığı% 13'e ulaşıyor.

Kombine değişiklikler.

Dönüşüm ve konjugasyon sonucu ortaya çıkar. Transformasyon, bir çift nükleotid içeren DNA genetik materyalinin bir bölümünün bir donör hücresinden bir reseptör hücresine transfer edilmesi işlemidir.

Dönüşüm sürecinde 5 aşama vardır:

1) Dönüştürücü DNA'nın bir mikrobiyal hücrenin yüzeyine adsorpsiyonu;

2) DNA'nın alıcı hücreye nüfuz etmesi;

3) Verilen DNA'nın hücrenin kromozomal yapılarıyla eşleştirilmesi;

4) Verici hücrenin bir DNA bölümünün, alıcı hücrenin kromozomal yapılarına dahil edilmesi;

5) Sonraki bölünmeler sırasında nükleotidde daha fazla değişiklik olması. Optimum dönüşüm sıcaklığı 29-32ͦС'dir.

Transdüksiyon, bir donör hücrenin genetik materyalinin bir transdüksiyon (ılıman) faj tarafından bir alıcı hücreye aktarıldığı bir değişikliktir; yok olmasına neden olmayan bir faj.

Üç tür transdüksiyon vardır:

1) Genel (spesifik olmayan), çeşitli veya birkaç özelliğin aktarımı aynı anda gerçekleşebilir.

2) Spesifik, yalnızca belirli bir özelliğin aktarılmasıyla karakterize edilir.

3) Abortif, bir faj tarafından alıcı hücreye aktarılan donör hücresinden alınan DNA'nın bir bölümü, genomuna dahil edilmez.

Konjugasyon, erkek ve dişi mikrobiyal hücrelerin birleştiği ve aralarında nükleer maddelerin değiş tokuş edildiği bir cinsel süreç biçimidir.

Bu durumda verici hücrenin genetik materyali alıcı hücreye geçer. Rekombinasyon ve hücre bölünmesi sonrasında konjuge hücrelerin özelliklerini taşıyan formlar oluşur.

Bu nedenle, birleştirici değişkenliğin üç biçiminin tümü (dönüşüm, transdüksiyon, konjugasyon) biçim açısından farklı, ancak öz olarak aynıdır. Transformasyon sırasında, donör hücresinin DNA bölümü alıcı hücreye girer; transdüksiyon sırasında bu rolü faj oynar; konjugasyon sırasında genetik bilginin aktarımı sitoplazmik bir köprü (pili) aracılığıyla gerçekleşir.

Rickettsia

Gram negatif mikroplar. Şekil: kısa çubuklar veya koklar. Rickettsiae gram negatif bakterilerin hücre duvarına benzer bir hücre duvarına sahiptir.

Gerçek bakteri olarak sınıflandırılırlar. Prokaryotlar.

Nitrifikasyon.

Protein bozunması ve üre bozunması ürünleri - amonyak ve amonyum tuzları - bitkiler tarafından doğrudan emilebilir, ancak bunlar genellikle nitrik asidin nitrat tuzlarına dönüştürülür.

Nitrifikasyonun ilk aşamasında, amonyak şemaya göre nitrik asite oksitlenir.

DG = -662kJ/mol.

Nitrifikasyon işlemi, bir dizi ara ürünün oluşmasıyla birkaç aşamada gerçekleşir: hidroksilamin, nitroksit, vb.

İkinci aşamada nitröz asit nitrik asite oksitlenir:

DG= -201kJ/mol.

Tek nitrifikasyon işleminin birinci ve ikinci aşamalarına farklı patojenler neden olur. S.N. Winogradsky onları üç cinste birleştirdi:

1) Nitrosomonas. Çubuk şeklindedirler, gram negatiftirler, hareketlidirler, tek flagellumla donatılmıştır ve spor oluşturmazlar. Toprakta yaygın olarak dağılırlar ve şekil ve büyüklük bakımından birbirlerinden farklıdırlar.

2) Nitrososistis. Zooglea (kapsülü çevreleyen mikropların kokkal formları) oluşturabilme yeteneği

3) nitrosospira. İki türe ayrılırlar. Her iki bakteri türü de düzenli bir spiral şekle sahiptir. Eski kültürlerde spiral olarak bükülmüş ipliklerin yanı sıra kısa çubuklar ve koklar da bulunur.

Son zamanlarda nitrifikasyonun ilk aşamasına neden olan iki mikrop türü daha tanımlandı.

Nitrifikasyon bakterileri organik maddeye karşı olumsuz bir tutuma sahiptir. Nitrifikasyon mikroplarının organik maddelere karşı güçlü duyarlılığı çözeltilerde gözlenir; Toprakta bu gözlenmez çünkü Hiçbir zaman önemli miktarlarda suda çözünebilen maddeler içermez.

Amonyak oksidasyon süreçleri yalnızca mikroplardan değil aynı zamanda onların enzimlerinden de etkilenir. Hariç organik madde Nitrifikasyon amonyak konsantrasyonundan etkilenir. Kültür üzerindeki etkisi sıvı ortamlarda keskin bir şekilde ortaya çıkar. Amonyak toprakta adsorbe edilmiş durumdadır ve engelleyici bir etkiye sahip olamaz. Bu nedenle Nitrobacter nitröz asidi hemen nitrik asite oksitler.

Oksijenin varlığı nitrifikasyon prosesi üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. Ekili topraklarda nitrifikasyon süreci daha yoğun gerçekleşir.

Rekombinasyon, orijinal nükleik asidin bir bölümünün homolog (benzer) bir bölümle değiştirilmesiyle ilişkili bir dizi işlemdir.

Bu durumda homolojinin derecesi farklı olabilir: orijinal ve yeni nükleotid dizilerinin tam özdeşliğinden, fenotipte bir değişikliğe yol açan gözle görülür farklılıklara kadar. Rekombinasyonun bir sonucu olarak yeni alel kombinasyonları oluşur, örneğin: AB + ab → Ab + aB.

Prokaryotlarda yabancı DNA'yı genoma dahil etmenin üç yolu vardır: dönüşüm, konjugasyon ve transdüksiyon.

dönüşüm

Transformasyon, saf DNA'nın bir hücreden diğerine aktarılmasıdır. Dönüşüm, bakteriyolog F. Griffiths tarafından 1928'de pnömokoklarla yapılan deneylerde keşfedildi. Pnömokokların iki türü vardır: S- ve R-formları.

S-formu, yapay olarak yetiştirildiğinde pürüzsüz, parlak koloniler oluşturduğu için bir polisakkarit kapsülün varlığıyla karakterize edilir; bu form fareler için patojendir. R-formunun bir kapsülü yoktur, yapay olarak yetiştirildiğinde kaba koloniler oluşturur; bu form fareler için patojenik değildir. Ancak öldürülen S hücreleri ve canlı R hücreleri aynı anda farelere enjekte edilirse fareler ölür. Bu nedenle bir suşun genetik özellikleri diğer bir suşun genetik özelliklerini etkiler.

1944 yılında O. Avery, K. McLeod ve M. McCarthy, hücrelerin kalıtsal özelliklerindeki değişikliklerin DNA transferiyle ilişkili olduğunu kanıtladılar.

Bir hücrenin dönüşebilmesi, onun yeterlilik denilen özel durumuyla mümkündür. Yetkili hücreler kompozisyonu değiştirir hücre çeperi ve plazmalemma: duvar gözenekli hale gelir, plazmalemma çok sayıda istila oluşturur ve dış yüzeyde özel antijenler belirir - yeterlilik faktörleri (özellikle düşük moleküler ağırlığa sahip spesifik proteinler).

Doğal koşullar altında prokaryotların ölümü (lizis) sırasında hücre dışı saf DNA oluşur.

Kural olarak, bir prokaryot türü içinde dönüşüm meydana gelir, ancak homolog genlerin varlığında türler arası dönüşüm de gözlenir.

Dönüşüm süreci aşağıdaki aşamaları içerir:

1. Dönüştürücü çift sarmallı DNA'nın alıcı hücrenin yüzeyindeki reseptörlere bağlanması.

2. Çift sarmallı DNA'nın tek sarmallıya dönüştürülmesi.

3. Tek sarmallı DNA'nın hücreye nüfuz etmesi.

4. Dönüştürücü DNA'nın alıcı kromozomuna entegrasyonu ve genetik materyalin rekombinasyonu.

Dönüştürücü DNA'nın uzunluğu 500 ila 200 bin bp arasında olmalıdır. DNA iplikçiklerinden birinin parçalanması sırasında açığa çıkan enerji, geri kalan ipliğin hücreye aktif taşınması için kullanılır.

Transformasyonun ilk üç aşaması DNA'nın nükleotid bileşimine bağlı değildir. Bununla birlikte, eğer bu DNA alıcı DNA'sına oldukça homologsa, transformasyon DNA'sının alıcı kromozomuna entegrasyon süreci daha olasıdır.

Dönüşüm süreci şemada gösterilmektedir. Her düz çizgi parçası bir DNA zincirine karşılık gelir. Dönüştürücü DNA siyah renkle gösterilir ve alıcı hücre DNA'sı gri renkle gösterilir.

İlk aşamada, transformasyona uğrayan DNA, alıcı hücrenin yüzeyindeki reseptör bölgelerine bağlanır.

İkinci aşamada, hücre yüzeyindeki çift iplikli DNA, ipliklerden birinin bakteriyel nükleazlar tarafından bölünmesi nedeniyle tek iplikli DNA'ya dönüştürülür.

Üçüncü aşamada, kalan DNA ipliği membrandan sitoplazmaya taşınır. Bu, tamamlayıcı zincirin bozulması sırasında açığa çıkan enerjiyi kullanır.

Bir bakteriyel kromozomun replikasyonu sırasında, dönüştürücü DNA zinciri, alıcı hücrenin homolog (kısmen tamamlayıcı) bir DNA bölgesine bağlanır. Bu durumda, tam tamamlayıcılık eksikliğinden dolayı, bir heterodubleks (“moleküler heterozigot”) oluşur - tüm nükleotid çiftlerinin hidrojen bağlarıyla bağlanan azotlu bazlara sahip olmadığı çift sarmallı DNA'nın bir bölümü. DNA'nın geri kalanı normal şekilde çoğalır.

DNA replikasyonunun sona ermesinden sonra, alıcı hücre iki hücre oluşturmak üzere bölünür: heterodubleks DNA bölgesi içeren bir kromozoma sahip kısmen dönüştürülmüş bir hücre ve dönüştürülmemiş bir hücre. Kısmen transforme edilmiş bir hücrede DNA replikasyonu sırasında, her iki DNA zincirinde tamamlayıcı zincirler tamamlanır. Bir iplik orijinal nükleotid dizisini korurken diğeri tamamen dönüştürülür. Kısmen dönüştürülmüş bir hücrenin bölünmesinden sonra, bir dönüştürülmemiş hücre ve bir tamamen dönüştürülmüş hücre oluşur; burada orijinal nükleotit sekansı, dönüştürücü DNA'nın nükleotit sekansı ile değiştirilir.

Böylece, dönüşüm sırasında alıcının genleri, homolog nükleotid dizileri ile değiştirilir. Homoloji derecesi ne kadar yüksek olursa dönüşüm o kadar başarılı olur.

Prokaryotlarda dönüşümün sıklığı, dönüştürücü DNA'nın özelliklerine, konsantrasyonuna, alıcı hücrenin durumuna ve bakteri türüne bağlıdır. Dönüştürülen hücrelerin maksimum frekansı 100 hücre başına 1'i geçmez.

Dönüşüm ökaryotlarda da bilinmektedir. Bununla birlikte, ökaryotik hücrelerin yüzeyinde hiçbir reseptör bölgesi yoktur ve dönüştürücü DNA, hücrelere yapay olarak sokulur. Örneğin DNA, hayvan yumurtalarına doğrudan mikroenjeksiyonla, bitki yumurtalarına ise polen tüpüne mikroenjeksiyonla veriliyor. Biyobalistik (biyolistik) yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır ve herhangi bir DNA fragmanının bitki doku kültürlerine dahil edilmesine olanak sağlamaktadır.

Birleşme

Prokaryotlarda konjugasyon, genetik materyalin donör hücreden alıcı hücreye en azından kısmen aktarılmasıyla birlikte, farklı kalitede iki hücrenin doğrudan temasıdır. (Konjugasyon süreci 1946'da J. Lederberg ve E. Tatum tarafından keşfedildi).

E. coli'de donör hücresi ("erkek") dikdörtgen bir şekle sahiptir, alıcı hücre ("dişi") ise izodiametriktir. Donör hücresi, onu alıcı hücreye çeken ve sitoplazmik kanallar oluşturan seks villisini (pili) oluşturur. Bu kanallar aracılığıyla DNA, verici hücreden alıcı hücreye geçer. Üç tür donör hücresi vardır: F + (ef-plus), Hfr (eh-ef-a) ve F′ (ef-prim).

F+ donörleri sitoplazmada spesifik bir F-plazmidi olan bir seks faktörü içerir.

F plazmidi yaklaşık 100 kb uzunluğunda otonom bir replikondur. F-plazmidinin bir parçası olarak 20'den fazla gen incelenmiştir. Bunların yaklaşık yarısı dev tra operonunu oluşturur (yaklaşık 30 kb uzunluğunda); Bu operonun ürünleri, donör ile alıcı arasındaki temasın oluşumunu ve DNA'nın fiili transferini kontrol eder. Geri kalan genler tra operonun işleyişini düzenler.

Alıcı hücre, F plazmidini içermez ve bir F hücresi olarak adlandırılır.

Bir sitoplazmik köprü oluştuğunda, F-plazmidinin zincirlerinden biri belirli bir noktada (O noktası) kesilir ve tamamlayıcı zincir üzerinde “yuvarlanan halka” prensibine göre DNA replikasyonu başlar. Tamamlayıcı zincirin bir kopyası sitoplazmik köprüden geçerek alıcı hücrenin sitoplazmasına geçer ve eksik zincir onun üzerinde tamamlanır. Replikasyon tamamlandıktan sonra çift sarmallı plazmid DNA bir halka şeklinde kapanır ve F – hücresi F+ hücresine dönüşür. F plazmidinin bir kopyasının alıcı hücreye aktarılması için toplam süre yaklaşık 5 dakikadır.

Bununla birlikte, F + × F – çaprazlanırken yalnızca içerdiği genler F–plazmit; Bakteri kromozomunda lokalize olan temizlik genleri alıcı hücreye aktarılmaz.

Aynı zamanda F-plazmidi bakteri kromozomuna entegre olabilir, yani entegre bir duruma girebilir. Bakteri kromozomunda yaklaşık 20 F-plazmid entegrasyon bölgesi vardır. Daha sonra F-plazmid zincirlerinden birinin bir kopyası alıcı hücreye aktarıldığında, bakteriyel kromozom zincirlerinden birinin bir kopyası da onunla birlikte taşınır. Entegre bir F-plazmidine sahip hücrelere Hfr-donörleri (İngilizce'den) denir. " yüksek frekans rekombinasyonlar"). Koşullara bağlı olarak donörün Hfr bakteri kromozomunun bir kopyasının alıcının sitoplazmasına tamamen veya kısmen aktarılması mümkündür. Sonuç olarak, bir orijinal çift sarmallı bakteri kromozomu ve bir tam veya eksik homolog tek sarmallı DNA molekülünden oluşan bir hücre oluşur. Böyle bir hücreye merozigot (“kısmi zigot”) denir. Daha sonra DNA replikasyonu sırasında rekombinasyon meydana gelir. Bu süreç temelde dönüşüm sırasındaki rekombinasyondan farklı değildir.

Bir DNA kopyasının transferi yaklaşık olarak F-plazmid DNA'nın ortasından başlar (DNA iplikçiklerinden birinin kesildiği ve F-plazmid DNA'nın replikasyonunun başladığı O noktasından). Böylece, F-plazmid DNA'nın yarısı, konjugasyonun başlangıcında alıcı hücreye girer ve ikinci yarısı, ancak kromozomal DNA'nın bir kopyasının tamamen transfer edilmesinden sonra girer. Bu işlemin tamamlanması t = 37 0 C'de 100 dakikadan fazla zaman alır. Ancak doğal koşullar altında konjugasyon çok daha erken kesilir; donör kromozomunun kopyasının yalnızca bir kısmı ve F-plazmit DNA'sının yalnızca ilk yarısı alıcı hücreye geçer. Böylece alıcı hücre, Hfr donörünün özelliklerini kabul etmez.

Ancak bakteri kromozomunun bir kopyasının F-plazmid DNA'sının bir kopyasıyla birlikte tamamen aktarıldığı bakteri türleri de vardır. Bu tür hücrelere vHfr donörleri adı verilir (İngilizce "çok yüksek rekombinasyon frekansı"ndan gelir).

Belirli bir genin alıcı hücreye aktarılma olasılığı, F-plazmid DNA'sından veya daha kesin olarak F-plazmid DNA'sının replikasyonunun başladığı O noktasından uzaklığına bağlıdır. Konjugasyon süresi ne kadar uzun olursa, belirli bir genin transfer olasılığı da o kadar yüksek olur. Bu, konjugasyondan birkaç dakika sonra bakterilerin genetik haritasını oluşturmayı mümkün kılar. Örneğin Escherichia coli'de thr geni (treonin biyosentezini kontrol eden üç genden oluşan bir operon) sıfır noktasında (yani doğrudan F-plazmid DNA'nın yanında) bulunur, lac geni 8 dakika sonra aktarılır, recE geni - 30 dakika sonra, argR geni - 70 dakika sonra vb.

F-plazmid, bakteriyel kromozomdan kendi kendine eksizyon yoluyla entegre bir durumdan otonom bir duruma geçebilir. Bu durumda kromozomal DNA'nın bazı kısımlarını (kromozomal genlerin %50'sine kadar) yakalamak mümkündür. Kromozomal genleri içeren F plazmitine F' faktörü denir. F ′ × F çaprazlamaları sırasında genetik materyalin transferine seksdüksiyon denir.

Prokaryotlarda F-plazmitin yanı sıra, genetik materyalin bakteriden bakteriye transferini sağlayan diğer cinsiyet faktörleri (R, Ent, Hly, Col) de bilinmektedir. Doğal plazmitlere (kloroplast ve mitokondri DNA'sı dahil) dayanarak, genetik materyalin bir hücreden diğerine vektör adı verilen transferini sağlayan yarı sentetik DNA molekülleri elde edilir. Vektörler sadece stabil gen transferini değil aynı zamanda transkripsiyonlarının düzenlenmesini de sağlamalıdır.

Prokaryotik plazmitler yalnızca prokaryotik hücrelerde çoğalabilir. Aynı zamanda genlerin ökaryotlardan prokaryotlara ve prokaryotlardan prokaryotlara aktarılmasına ihtiyaç vardır. Bu amaçla, iki replikatör (prokaryotik ve ökaryotik) içeren ve hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde replikasyon yapabilen, örneğin prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde replikasyon yapabilen Ti- ve Ri-plazmitleri içeren mekik plazmitleri kullanılır. bitki hücreleri ve bunlara dayalı olarak oluşturulan yarı sentetik vektörler. Vektörleri nükleazların tahribatından korumak için fosfolipit kesecikleri - lipozomlar içine alınırlar.

İletim

Transdüksiyon, genetik materyalin virüsler kullanılarak donör hücresinden alıcı hücreye aktarılmasıdır. (Transdüksiyon olgusu 1951'de N. Zinder (J. Lederberg'in öğrencisi) tarafından keşfedildi).

Transdüksiyon sırasında konakçı hücreden gelen DNA viryonlara girer. Virionlar diğer hücreleri enfekte eder ve orijinal bakteri hücresinin DNA'sı başka bir bakteri hücresine girer. Viral DNA, bakteri kromozomuna entegre olur ve eklenen bakteri DNA'sı, bakteri kromozomunun DNA'sı ile yeniden birleşir. Sonuç olarak hücrelerin %50'si dönüşür.

Genel (spesifik olmayan), sınırlı (spesifik) ve abortif transdüksiyon vardır.

Genel transdüksiyon

Genel transdüksiyon sırasında, donör bakteri DNA'sının fragmanları, faj DNA'sı ile birlikte veya faj DNA'sı yerine olgunlaşan faj partikülüne rastgele dahil edilir. Bakteriyel DNA fragmanları, faj kontrollü bir enzim tarafından kesildiğinde oluşur. Bir faj parçacığı 100'e kadar bakteri geni içerebilir.

Sınırlı iletim

Sınırlı transdüksiyonla rekombinasyon meydana gelir - bakteriyel DNA, faj DNA'sının bir kısmının yerini alır. Rekombinant DNA, bakteri kromozomuna entegre edilmiş faj DNA'sına bitişik az sayıda bakteriyel gen içerir.

Genel ve sınırlı transdüksiyonda, donör DNA'sı, alıcının DNA'sının homolog bölgelerinin yerini alır. Bu süreç dönüşüme benzer.

Abortif transdüksiyon hem spesifik olmayan hem de spesifik olabilir. Bunun özü, faj tarafından aktarılan DNA fragmanının alıcı kromozomuna dahil edilmemesi, sitoplazmik bir replikon olarak var olması gerçeğinde yatmaktadır. Er ya da geç bu kopya kaybolur.

Virüsler tarafından transdüksiyon olgusu, ökaryotlarda gen transferinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Kapsid oluşturamayan (yani yalnızca DNA formunda mevcut olan) bir virüs kullanılırsa transdüksiyon, temelde transformasyondan veya genetik materyalin plazmit vektörleri kullanılarak konjugatif transferinden farklı değildir. Değiştirilmiş SV40 virüsleri (bir hücrede 100 bine kadar kopya oluştururlar), herpes, aşı ve karnabahar mozaik virüsü temel alınarak vektör sistemleri oluşturulmuştur.

Açıklanan tüm rekombinasyon türlerinin yeni DNA bölümlerinin eklenmesiyle değil, mevcut nükleotid dizilerinin değiştirilmesiyle ilişkili olduğu bir kez daha vurgulanmalıdır. Dönüştürücü ve orijinal DNA arasındaki homoloji derecesi ne kadar yüksek olursa, başarılı rekombinasyon olasılığı da o kadar yüksek olur. Rekombinasyonu sağlamanın en kolay yolu tüm organizmalarda bulunan enzimlerdir. Genom için oldukça spesifik olan yeni düzenleyicilerin tanıtılması daha zordur. Bu nedenle genoma yeni genler eklemek için DNA'nın biyokimyasal modifikasyonlarıyla ilişkili daha karmaşık yöntemler kullanılır.

Konu 7: Sitoplazmik kalıtım . Somatik hücre ve dokuların genetiği.

1. Sitoplazmik kalıtım. Yarı otonom organellerin genetik materyali. Plastid kalıtımı. Mitokondri yoluyla kalıtım. Sitoplazmik erkek kısırlığı

2. Özel miras türleri. Sitoplazmanın önceden belirlenmesi. Enfeksiyon ve endosembiyoz ortakları yoluyla kalıtım

3. Somatik hücrelerin genetiği. Somatik mutasyonlar. Kimeralar. Kanserin genetiği.

Konu: Mikroorganizmaların genetiği 1. Konjugasyon, transdüksiyon, transformasyon. 2. Mikroorganizmaların değişkenliği. 3. Bakteri genetiğinin kazanımlarını kullanmak.

Bakterilerin kalıtsal aparatının bir takım özellikleri vardır: bakteriler haploid organizmalardır, yani. 1 kromozomları vardır. Bu bakımdan özelliklerin miras alınmasında baskınlık olgusu yoktur; Bakteriler yüksek bir üreme oranına sahiptir ve bu nedenle kısa bir süre (günler) içinde birkaç düzine bakteri neslinin yerini alır. Bu, büyük popülasyonları incelemeyi ve nadir görülen mutasyonları bile kolayca tanımlamayı mümkün kılar. Bakterilerin kalıtsal aparatı bir kromozomla temsil edilir. Bakterilerde tek bir tane bulunur. Bakteri kromozomu bir DNA molekülüdür. Bu molekülün uzunluğu 1,0 mm'ye ulaşır ve bir bakteri hücresine "sığdırmak" için ökaryotlarda olduğu gibi doğrusal değildir, ancak ilmekler halinde aşırı sarılmış ve bir halka şeklinde katlanmıştır. Bu halka sitoplazmik membrana bir noktada bağlanır. Bireysel genler bakteri kromozomunda bulunur. Mesela E. coli'de 2 binden fazla var.

2. Fonksiyonel birimler Bakteriyel genom, kromozomal genlere ek olarak şunları içerir: IS dizileri; transpozonlar; plazmidler. IS dizileri (İngilizce ekleme - ekleme, dizi - dizi) kısa DNA fragmanlarıdır. Yapısal genler taşımazlar (belirli bir proteini kodlayan), ancak yalnızca transpozisyondan (IS dizilerinin kromozom boyunca hareket etme ve çeşitli bölümlerine entegre olma yeteneği) sorumlu genleri içerirler. IS dizileri aynı farklı şekiller bakteriler. Transpozonlar IS dizilerinden daha büyük DNA molekülleridir. Transpozisyondan sorumlu genlerin yanı sıra belirli bir özelliği kodlayan yapısal bir gen de içerirler. Transpozonlar (Tn elemanları) 2000-25.000 nükleotid çiftinden oluşur, spesifik genleri taşıyan bir DNA fragmanı ve iki terminal IS elemanı içerir. Her transpozon genellikle bakteriye antibakteriyel ajanlara karşı çoklu direnç gibi önemli karakteristikler kazandıran genler içerir. Genel olarak transpozonlar, plazmidlerle aynı genlerle (antibiyotik direnci, toksin oluşumu, ek metabolik enzimler) karakterize edilir. Transpozonlar bir kromozom boyunca kolayca hareket eder. Konumları hem kendi yapısal genlerinin hem de komşu kromozomal genlerin ifadesini etkiler. Transpozonlar kromozomun dışında da bulunabilir.

Plazmitler dairesel süperhelikal DNA molekülleridir. Molekül ağırlıkları çok değişkendir ve transpozonlarınkinden yüzlerce kat daha fazla olabilir. Plazmitler, bakteri hücresine kendisi için çok önemli olan çeşitli özellikleri kazandıran yapısal genler içerir: R-plazmidler - ilaç direnci; Col-plasmidler - kolisinleri sentezleme yeteneği; F-plazmitleri - genetik bilgiyi iletir; Tox plazmitleri - toksini sentezler; Biyolojik bozunma plazmitleri - bir veya diğer substratı vb. yok eder. Plazmidler kromozoma entegre edilebilir (IS dizileri ve transpozonlardan farklı olarak, kesin olarak tanımlanmış alanlara gömülürler) veya özerk olarak var olabilirler. Bu durumda otonom olarak çoğalma yeteneğine sahiptirler ve bu nedenle bir hücrede böyle bir plazmidin 2, 4, 8 kopyası bulunabilir. Birçok plazmid, aktarılabilirlik genleri içerir ve konjugasyon (genetik bilgi alışverişi) yoluyla bir hücreden diğerine aktarılma yeteneğine sahiptir. Bu tür plazmitlere bulaşıcı denir.

Bakterilerde fenotipik ve genotipik olmak üzere 2 tür değişkenlik vardır. Fenotipik değişkenlik (modifikasyon) genotipi etkilemez ancak popülasyondaki bireylerin çoğunluğunu etkiler. Değişiklikler kalıtsal değildir ve zamanla kaybolur; yani daha büyük (uzun vadeli değişiklikler) veya daha küçük (kısa süreli değişiklikler) sayıda nesil yoluyla orijinal fenotipe geri dönerler. h Genotipik varyasyon genotipi etkiler. Mutasyonlara ve rekombinasyonlara dayanmaktadır. Bakterilerdeki mutasyonlar temel olarak ökaryotik hücrelerdeki mutasyonlardan farklı değildir. Bakterilerdeki mutasyonların bir özelliği, büyük bakteri popülasyonlarıyla çalışmak mümkün olduğundan, bunların tanımlanmasının göreceli kolaylığıdır. Köken itibarıyla mutasyonlar şunlar olabilir: kendiliğinden; indüklendi. Uzunluğa göre: noktasal; genetik; kromozomal. Yönlülük: düz; - tersi.

Bakterilerdeki rekombinasyon (genetik materyal değişimi), ökaryotlardaki rekombinasyondan farklıdır: bakterilerin çeşitli rekombinasyon mekanizmaları vardır; bakterilerde rekombinasyon sırasında, ökaryotlarda olduğu gibi bir zigot değil, bir merozigot oluşur (alıcının tüm genetik bilgisini ve donörün genetik bilgisinin bir kısmını ilave şeklinde taşır); Rekombinant bakteri hücresinde genetik bilginin yalnızca niteliği değil miktarı da değişir.

Konjugasyon Bakterilerde genetik materyalin bir bakteri hücresinden diğerine aktarılması yöntemi. Bu durumda, iki bakteri, bir deoksiribonükleik asit (DNA) ipliğinin bir bölümünün bir hücreden (vericiden) diğerine (alıcıya) geçtiği ince bir köprü ile bağlanır. Alıcının kalıtsal özellikleri, aktarılan DNA parçasının içerdiği genetik bilgi miktarına göre değişmektedir.

Konjugasyon Konjugasyon (Latince conjugatio'dan - bağlantı), paraseksüel süreç - iki bakteri hücresinin doğrudan teması yoluyla genetik materyalin bir kısmının (plazmitler, bakteri kromozomu) tek yönlü aktarımı. 1946 yılında J. Lederberg ve E. Taitem tarafından keşfedilmiştir. Doğada büyük öneme sahiptir çünkü gerçek bir cinsel sürecin yokluğunda yararlı özelliklerin değişimini teşvik eder. Tüm yatay gen transferi süreçleri arasında konjugasyon, en fazla miktarda genetik bilginin transferine olanak sağlar.

Konjugasyon, bakterilerdeki genetik bilginin doğrudan temas yoluyla donörden alıcıya aktarılarak değişimidir. Donör ve alıcı arasında bir konjugasyon köprüsü oluştuktan sonra, donör DNA'sının bir ipliği alıcı hücreye bunun üzerinden girer. Temas ne kadar uzun olursa, çoğu donör DNA'sı alıcıya aktarılabilir. Belirli aralıklarla konjugasyonun kesintiye uğramasına dayanarak, bakteri kromozomu üzerindeki genlerin sırasını belirlemek - bakterilerin kromozomal haritalarını (bakteri haritasını) oluşturmak mümkündür. F+ hücrelerinin donör işlevi vardır.

Transdüksiyon Esther Lederberg, 1950'de Escherichia coli K 12'den bir DNA virüsü olan bakteriyofaj lambda'yı izole etmeyi başardı. Transdüksiyonun gerçek keşfi Joshua Lederberg'in adıyla ilişkilidir. 1952'de Norton Zinder ile birlikte genel iletimi keşfettiler. 1953'te Lederberg ve arkadaşları, başarısız transdüksiyonun ve 1956'da spesifik transdüksiyonun varlığını gösterdi.

Transdüksiyon, bakterilerdeki genetik bilginin, ılıman (dönüştürücü) bakteriyofajlar kullanılarak donörden alıcıya aktarılarak değişimidir. Transdüksiyon fajları 1 veya daha fazla gen (özellik) aktarabilir. Transdüksiyon şu şekilde olabilir: spesifik - her zaman aynı gen aktarılır; spesifik olmayan - farklı genler aktarılır. Bunun nedeni, donör genomunda transdüksiyon fajlarının lokalizasyonudur: spesifik transdüksiyon durumunda, bunlar her zaman kromozom üzerinde aynı yerde bulunurlar; Spesifik olmadığında yerelleştirmeleri tutarsızdır.

Pirinç. 2. Transdüksiyon 1 - bakteri - donör (B+), 2 - faj, 3 - üreme, 4 - adsorpsiyon, 5 - bakteri - alıcı (B-), 6 - bakteri - yeni bir özelliğe sahip alıcı.

Transformasyon, alıcı bakteri hücresine sokularak bakterilerdeki genetik bilginin değişimidir. tamamlanmış ürün DNA (özel olarak hazırlanmış veya doğrudan donör hücresinden izole edilmiş). Çoğu zaman genetik bilginin aktarımı, alıcının donör DNA'sı içeren bir besin ortamında yetiştirilmesiyle gerçekleşir. Dönüşüm sırasında donör DNA'sının algılanabilmesi için alıcı hücrenin belirli bir durumda olması gerekir. fizyolojik durum Bakteri popülasyonunun özel işlenmesi yöntemleriyle elde edilen veya kendiliğinden ortaya çıkan (yeterlilik). Dönüşüm sırasında tek (genellikle 1) karakteristik iletilir. Transformasyon, alıcı hücreye saf bir DNA preparatı verildiğinden, DNA'nın veya parçalarının belirli bir fenotipik özellik ile bağlantısının en nesnel kanıtıdır.

Pirinç. 3. Aşılandığında kapsüler bakteri türünün (1) dönüşümü büyümeyi (6) sağlar. Bu kültürü kaynattıktan sonra üreme olmaz (7). Kapsül olmayan bir suşla (4 -büyüme +, 8 -büyüme -) böyle bir deneyin sonucu benzerdir. Kapsül ekstraktının (1) ve kapsüler suşların (3) canlı kültürünün tek bir kapta birleştirilmesi, ardından tohumlama, kapsüler suşun (5) büyümesini sağlar.

Koloni hücrelerinin özellikleri S - ve R-formları S-formu R-formu Koloniler pürüzlü, opak ve pürüzlü kenarlara sahip, sıklıkla buruşuk Flagella sıklıkla yoktur Kapsüller veya mukoza tabakası yoktur Biyokimyasal olarak daha az aktif Biraz öldürücü veya avirülent Antijenik olarak yetersiz Fajlara karşı zayıf duyarlı Süspansiyon hızla yerleşir, ufalanan çökelti, polimorfik hücreler Koloniler şeffaf, pürüzsüz, parlak bir yüzeye sahip, yuvarlak, düzgün kenarlı, dışbükey Hareketli türlerde flagella bulunur Kapsül türlerde kapsül veya mukoza tabakası açıkça görülebilir Biyokimyasal olarak daha aktif Patojenik türlerde virülan özellikler ifade edilir Antijenik olarak tam Fajlara duyarlı Süspansiyon hücreleri tuzlu su çözeltisi homojen, stabil, normal büyüklükte hücreler

Genetik rekombinasyonlar- Ebeveynlerin genetik materyalinin yavrularda yeniden dağıtılması, organizmaların birleşik değişkenliğine neden olur. Bireysel genlerdeki enzimlerin katılımıyla oluşurlar.

Birleşme - genetik materyalin verici hücreden alıcı hücreye yakın temas yoluyla aktarılması. Genetik materyalin donörleri F-plazmidini taşıyan hücrelerdir. F plazmitine sahip olmayan bakteri hücreleri alıcılardır.

Konjugasyonun ilk aşaması donör hücresinin genital villus kullanılarak alıcıya bağlanmasıdır. Hücreler arasında, F-plazmidinin donör hücresinden alıcı hücreye aktarıldığı bir konjugasyon köprüsü oluşturulur.

F plazmidi bakteri kromozomuna yerleştirilirse, endonükleazın katılımıyla bir DNA zinciri kırılır. DNA'nın yakın ucu, bir konjugasyon köprüsü yoluyla alıcı hücreye girer ve hemen çift sarmallı bir yapıya tamamlanır. Donör hücresinde kalan iplik, ikinci ipliğin sentezi için matristir.

dönüşüm– Vericinin genetik materyalinin alıcı hücreye doğrudan aktarılması. Transformasyon etkili bir şekilde yalnızca aynı türün farklı genotiplere sahip bakterileri arasında meydana gelir.

Donör DNA'sını kabul edebilen hücrelere yetkin hücreler denir. Yeterlilik durumu hücre büyümesi sırasında ortaya çıkar ve logaritmik fazın sonuna denk gelir.

Molekül ağırlığı en az 0,5-1x106 olan çift sarmallı DNA fragmanları, dönüştürme aktivitesine sahiptir

Dönüşüm süreci aşamalardan oluşur:

1) donör DNA'sının alıcı hücreye adsorpsiyonu,

2) DNA'nın alıcı hücreye nüfuz etmesi ve ardından despiralizasyon,

3) bir DNA zincirinin alıcı kromozomun homolog bir bölgesi ile bağlantısı.

Transdüksiyon – genetik materyalin fajlar kullanılarak bir bakteriden diğerine aktarılması. Var:

1) spesifik olmayan transdüksiyon– Herhangi bir donör geni, faj DNA'sı ile birlikte alıcı hücreye aktarıldığında. Faj tarafından aktarılan donör bakterisinin DNA fragmanı, rekombinasyon yoluyla alıcı hücrenin DNA'sının homolog bölgesine dahil edilebilir. Dönüştürücü faj yalnızca bir bakteriden diğerine genetik materyalin taşıyıcısıdır ve faj DNA'sının kendisi rekombinantların oluşumuna katılmaz,

2) spesifik transdüksiyon - faj, spesifik genleri donör bakteriden alıcı bakteriye aktarır. Dönüştürücü fajlar, alıcı suşun hücreleriyle etkileşime girdiğinde, donör bakterinin geni, kusurlu fajın DNA'sı ile birlikte alıcı bakterinin kromozomuna dahil edilir.

3) kürtaj yapan– faj tarafından getirilen donör bakterinin DNA fragmanının, alıcı bakterinin kromozomunda yer almaması, sitoplazmasında yer alması ve bu formda görev yapabilmesi. Bir rekombinant bakteri hücresinin bölünmesi sırasında, getirilen donör DNA parçası, yavru hücrelerden yalnızca birine aktarılır ve zamanla yok olur.

Konu 6: Enfeksiyon doktrini. Kemoterapi ilaçları. Antibiyotikler.

Bireysel çalışma için sorular:

1. Enfeksiyon. Patojenin oluşma koşulları ve bulaşma yolları.

2. Enfeksiyon formları ve özellikleri.

3. Bulaşıcı hastalık dönemleri.

4. Bakteriyel toksinlerin özellikleri.

5. Antibiyotikler: sınıflandırma, uygulama, antibiyotik alırken komplikasyonlar.

6. Mikroorganizmaların antibiyotiklere duyarlılığını belirleme yöntemleri.

7. Kemoterapi ilaçlarının en önemli grupları ve etki mekanizmaları.

Bireysel çalışma için teorik materyal :

Eklenme tarihi: 2015-09-03 | Görüntülemeler: 888 | Telif hakkı ihlali