Genetske rekombinacije: transdukcija, transformacija, konjugacija, transpozicija. Koncept genetskog inženjeringa

Upoznali smo se sa procesom umnožavanja DNK, kada se na jednom lancu gradi drugi lanac, kao na matrici. Međutim, u prirodi postoje procesi povezani s promjenama u strukturi DNK, ali te promjene idu u drugim smjerovima.

Transformacija- uvođenje genetske informacije u ćeliju korištenjem izolirane deoksiribonukleinske kiseline (DNK). Transformacija dovodi do pojave u transformiranoj ćeliji (transformantu) i njenom potomstvu novih osobina karakterističnih za objekat – izvor DNK. Fenomen je 1928. godine otkrio engleski naučnik F. Griffith, koji je zapazio nasljednu obnovu sinteze kapsularnog polisaharida u pneumokokama kada su miševi bili zaraženi mješavinom inkapsuliranih bakterija ubijenih toplinom i stanica bez kapsule. Mišji organizam u ovim eksperimentima igrao je ulogu svojevrsnog detektora, budući da je stjecanje kapsularnog polisaharida informiralo stanice kojima nedostaje kapsula da izazovu infektivni proces koji je fatalan za životinju. U kasnijim eksperimentima je utvrđeno da se transformacija odvija i kada se pneumokokama bez kapsule, umjesto ubijenih ćelija, dodaje ekstrakt uništenih inkapsuliranih bakterija. Godine 1944. O. Avery i saradnici (SAD) ustanovili su da su molekuli DNK faktor koji osigurava transformaciju. Ovaj rad je prva studija koja dokazuje ulogu DNK kao nosioca nasljednih informacija.

Osim pneumokoka, transformacija je otkrivena i proučavana u nekoliko drugih bakterija.

Transformacija u bakterijama se smatra složenim procesom koji uključuje sljedeće faze:

Fiksacija molekula DNK od strane ćelije primaoca;

Penetracija DNK u ćeliju;

Ugradnja transformirajućih fragmenata DNK u hromozom ćelije domaćina;

Formiranje "čistih" transformiranih varijanti.

Fiksacija DNK događa se na posebnim područjima površine ćelije (receptorima), čiji je broj ograničen. DNK vezana za receptor ostaje osjetljiva na djelovanje enzima deoksiribonukleaze dodanog mediju, što uzrokuje njegov razgradnju. Međutim, nakon vrlo kratkog vremena (unutar 1 min) nakon fiksacije, dio DNK ulazi u ćeliju. Bakterijske ćelije istog soja oštro se razlikuju u permeabilnosti DNK. Zovu se ćelije određene bakterijske populacije koje su sposobne da inkorporiraju stranu DNK kompetentan . Broj kompetentnih ćelija u populaciji je neznatan i zavisi od genetskih karakteristika bakterije i faze rasta bakterijske kulture. Razvoj kompetencije povezan je sa sintezom posebnog proteina koji osigurava prodiranje DNK u ćeliju.

Prosječna veličina fragmenata DNK koji prodiru u ćeliju je 5×106 daltona. Budući da određeni broj takvih fragmenata može istovremeno ući u kompetentnu ćeliju, ukupna količina apsorbirane DNK može biti približno jednaka veličini hromozoma ćelije domaćina. Nakon što dvolančana DNK prodre u ćeliju, jedan lanac se raspada na mono- i oligonukleotide, a drugi se svojim prekidima i spajanjem integriše u hromozom ćelije domaćina. Naknadna replikacija takve hibridne strukture dovodi do izolacije "čistih" klonova transformanata, u čijem potomstvu je fiksirano svojstvo kodirano uključenom DNK.

Primjena transformacije omogućila je izvođenje genetska analiza bakterije kod kojih nisu opisani drugi oblici genetske razmjene (konjugacija, transdukcija). Pored toga, transformacija je pogodna metoda za razjašnjavanje efekata fizičkih ili hemijskih promena u njegovoj strukturi na biološku aktivnost DNK. Razvoj metode coli omogućilo je korištenje za transformaciju ne samo fragmenata bakterijskog kromosoma, već i DNK bakterijskih plazmida i bakteriofaga. Ova metoda se široko koristi za uvođenje hibridne DNK u ćeliju u istraživanju genetskog inženjeringa.

transdukcija(od latinskog transductio - kretanje) - prijenos genetskog materijala iz jedne ćelije u drugu uz pomoć virusa, što dovodi do promjene nasljednih svojstava stanica primatelja. Fenomen transdukcije otkrili su američki naučnici D. Lederberg i N. Zinder 1952. Posebni bakterijski virusi - umjereni fagi u procesu vegetativne reprodukcije u stanju su slučajno uhvatiti i prenijeti u druge ćelije bilo koji segment DNK koji se lizira, tj. uništene od njih, bakterije ( general , ili nespecifične , transdukcija). Dužina prenesenog (transduciranog) segmenta DNK određena je veličinom proteinske ljuske čestice faga i obično ne prelazi 1-2% bakterijskog genoma. Preneseni segment može sadržavati nekoliko gena. Budući da vjerojatnost takve povezane transdukcije ovisi o udaljenosti između gena u molekuli DNK koja formira bakterijski hromozom, fenomen transdukcije se široko koristi u kompilaciji genetskih mapa bakterijskih hromozoma. Genetski materijal faga je odsutan u takvim transducirajućim česticama; stoga, unošenjem DNK u ćeliju, oni ne izvršavaju sve ostale funkcije faga: ne umnožavaju se, ne lizogeniziraju ćeliju i ne daju joj imunitet na fag. Uvedeni fragment može postojati u ćeliji kao dodatni genetski element sa funkcionalnom aktivnošću. Budući da takav fragment nije sposoban za reprodukciju, pri svakoj diobi ćelije on se prenosi samo na jednu ćerku ćeliju. Sa izuzetkom ove ćelije, svojstva ostatka potomstva ostaju nepromijenjena ( neuspješan transdukcija). Nakon toga, fragment se može ili uništiti ili ugraditi u bakterijski hromozom, zamjenjujući homolognu DNK regiju u njemu. U potonjem slučaju, nove osobine koje je stekla transduktivna stanica bit će karakteristične za svo potomstvo ove stanice ( kompletan transdukcija).

Postoji grupa bakteriofaga sposobnih da transduciraju samo određene gene koji se nalaze blizu mjesta uključivanja genoma faga u bakterijski hromozom tokom lizogenizacije ( ograničeno , ili specifično , transdukcija). Takve transducirajuće čestice faga, nastale kao rezultat slučajnog kršenja točnosti procesa izlaska profaga iz bakterijskog kromosoma, sadrže molekulu DNK koja se sastoji od ostatka genoma faga i fragmenta bakterijskog genoma. U većini slučajeva ne mogu se sami razmnožavati niti lizogenezu bakterije zbog gubitka dijela genoma faga (do 30%). Genetski materijal transducirajućih čestica može biti pohranjen u ćeliji u autonomnom stanju ili ugrađen u bakterijsku DNK kao profag. Međutim, u oba slučaja, dio potomstva vraća prvobitna svojstva zbog gubitka profaga. Stabilna transdukcija se postiže samo ako je bakterijski fragment profaga uključen u bakterijski genom kao rezultat zamjene za homolognu regiju hromozoma.

episomes(od epi... i grčkog sóma - tijelo) - genetski faktori koji mogu biti u ćeliji ili u autonomnom (u citoplazmi) ili u integriranom (uključenom u hromozom) stanju; su molekuli DNK. Episomi uključuju genom umjerenog lambda faga, polni faktor F, neke R-faktore koji bakterije čine otpornima na određene lijekove, supstance i neke druge.Episomi nisu bitne komponente stanica i mogu se kretati iz jednog stanja u drugo, što zavisi od vrste ćelije. Na primjer, genom umjerenog lambda faga u stanicama Escherichia coli može biti u integriranom ili autonomnom stanju, dok je u stanicama patogena tifusa samo u autonomnom stanju. Kada su u autonomnom stanju, većina epizoma se ponaša kao tipični plazmidi. Brojni autori vide epizome kao prijelaznu vezu između struktura koje određuju kromosomsko i nehromozomsko nasljeđe.

DNK dijagnostika

Ljudsko tijelo je stanište za stotine vrsta bakterija i virusa. Sa biološke tačke gledišta, ljudsko tijelo je čitav sistem koegzistirajućih simbiontskih organizama. Nisu svi simbionti patogeni. Bez nekih vrsta bakterija čovjek jednostavno ne može postojati, njihov gubitak ili smanjenje broja uzrok je razvoja brojnih ozbiljne bolesti. Dešifriranje genoma mnogih patogena uz identifikaciju svih proteina pomoći će razvoju metoda za prevenciju i liječenje zaraznih bolesti.

Za razvoj infektivnog procesa veliki značaj ima genetski status samog domaćina. Na primjer, neke osobe su nosioci virusa imunodeficijencije, ali ne obolijevaju od AIDS-a. Ove osobe imaju mutaciju u genu koji kodira površinski protein odgovoran za ulazak virusa u limfoidne ćelije. Gustoća proteina na površini ćelija je smanjena, virus se zadržava, ali ne ulazi unutra. Učestalost homozigota za ovu mutaciju među Evropljanima je oko 1%, oni imaju izraženu otpornost na HIV infekcije. Nosioci heterozigotnih mutacija također su otporniji; u ruskoj populaciji njihova učestalost doseže 13%.

Promjene kombinacije.

Pojavljuju se kao rezultat transformacije i konjugacije. Transformacija je proces prijenosa dijela DNK genetskog materijala koji sadrži jedan par nukleotida iz ćelije donora u ćeliju receptora.

Postoji 5 faza u procesu transformacije:

1) Adsorpcija transformisane DNK na površini mikrobne ćelije;

2) Penetracija DNK u ćeliju primaoca;

3) Uparivanje unesene DNK sa hromozomskim strukturama ćelije;

4) Ugradnja dela DNK ćelije donora u hromozomske strukture ćelije primaoca;

5) Dalja promjena nukleotida tokom narednih podjela. Optimalna temperatura transformacije je 29-32C.

Transdukcija je promjena u kojoj se genetski materijal ćelije donora prenosi transducirajućim (umjerenim) fagom u ćeliju primaoca, tj. faga koji ne uzrokuje njegovo uništenje.

Postoje tri vrste transdukcije:

1) Opšte (nespecifično), može doći do prenošenja različitih ili više znakova istovremeno.

2) Specifična, koju karakteriše prenos samo određene osobine.

3) Abortivno, DNK region ćelije donora, prebačen od strane faga u ćeliju primaoca, nije uključen u njen genom.

Konjugacija je oblik seksualnog procesa u kojem su muške i ženske mikrobne stanice povezane i između njih se razmjenjuje nuklearna tvar.

U ovom slučaju, genetski materijal ćelije donora prelazi u ćeliju primaoca. Nakon rekombinacije i diobe stanice nastaju oblici sa znacima konjugacije stanica.

Dakle, sva tri oblika kombinativne varijabilnosti (transformacija, transdukcija, konjugacija) su različita po obliku, ali identična u suštini. Prilikom transformacije, dio DNK ćelije donora ulazi u ćeliju primaoca, tokom transdukcije tu ulogu obavlja fag, a tokom konjugacije, prijenos genetske informacije se vrši preko citoplazmatskog mosta (pili).

Rickettsia

Gram-negativni mikrobi. Oblik je kratkih štapića ili kokica. Rikecije imaju ćelijski zid koji je sličan zidu gram-negativnih bakterija.

Klasifikovane su kao prave bakterije. Prokarioti.

Nitrifikacija.

Produkti raspadanja proteina i razgradnje uree, amonijaka i amonijevih soli, biljke mogu direktno apsorbirati, ali se obično pretvaraju u nitrate dušične kiseline.

U prvoj fazi nitrifikacije, amonijak se oksidira u dušičnu kiselinu prema shemi

DG = -662kJ/mol.

Proces nitrifikacije odvija se u nekoliko faza, sa formiranjem niza međuproizvoda: hidroksilamina, nitroksida itd.

U drugoj fazi, dušična kiselina se oksidira u dušičnu kiselinu:

DG= -201kJ/mol.

Prva i druga faza jednog procesa nitrifikacije uzrokovane su različitim patogenima. S.N. Vinogradsky ih je grupisao u tri roda:

1) Nitrozomonas. Oni su u obliku štapa, gram-negativni, pokretni, opremljeni jednim flagelom, ne stvaraju spore. Široko su rasprostranjeni u tlu i međusobno se razlikuju po obliku i veličini.

2) Nitrosocistis. Sposobni da formiraju zoogley (kokni oblici mikroba koji okružuju kapsulu)

3) Nitrosospira. Podijeljeni su u dvije vrste. Bakterije obe vrste imaju pravilan spiralni oblik. Uz spiralno uvijene niti, kratki štapići i kokice nalaze se u starim kulturama.

Nedavno su identificirana još dva roda mikroba koji uzrokuju prvu fazu nitrifikacije.

Nitrificirajuće bakterije imaju negativan stav prema organskim tvarima. U otopinama je zabilježena jaka osjetljivost nitrificirajućih mikroba na organske tvari; ovo se ne primećuje u tlu, jer nikada ne sadrži tvari rastvorljive u vodi u značajnim količinama.

Na procese oksidacije amonijaka ne utječu samo mikrobi, već i njihovi enzimi. Osim organske tvari, na nitrifikaciju utječe i koncentracija amonijaka. Njegovo djelovanje na kulturu oštro se očituje u tečnim podlogama. U tlu je amonijak u adsorbiranom stanju i ne može djelovati depresivno. Stoga nitrobakter odmah oksidira dušičnu kiselinu u dušičnu kiselinu.

Prisustvo kiseonika ima pozitivan efekat na proces nitrifikacije. U kultivisanim zemljištima proces nitrifikacije teče intenzivnije.

Rekombinacija je skup procesa povezanih sa zamjenom mjesta originalne nukleinske kiseline homolognim (sličnim) mjestom.

U ovom slučaju, stepen homologije može biti različit: od potpunog identiteta originalne i nove sekvence nukleotida do uočljivih neslaganja koja dovode do promene fenotipa. Kao rezultat rekombinacije nastaju nove kombinacije alela, na primjer: AB + ab → Ab + aB.

Kod prokariota postoje tri načina ugradnje strane DNK u genom: transformacija, konjugacija i transdukcija.

Transformacija

Transformacija je prijenos čiste DNK iz jedne ćelije u drugu. Transformaciju je otkrio bakteriolog F. Griffiths 1928. u eksperimentima s pneumokokama. Kod pneumokoka su poznate dvije vrste sojeva: S- i R-oblici.

S-oblik karakterizira prisustvo polisaharidne kapsule, zbog čega, tokom vještačkog uzgoja, formira glatke, sjajne kolonije; ovaj oblik je patogen za miševe. R-oblika nema kapsulu, tokom vještačkog uzgoja formira grube kolonije; ovaj oblik je nepatogen za miševe. Ali ako se miševima ubrizgaju ubijene S-ćelije i žive R-ćelije u isto vrijeme, miševi umiru. Stoga, genetska svojstva jednog soja utiču na genetička svojstva drugog soja.

Godine 1944. O. Avery, K. McLeod i M. McCarthy su dokazali da su promjene u nasljednim svojstvima ćelija povezane s prijenosom DNK.

Sposobnost ćelije da se transformiše je moguća u njenom posebnom stanju, koje se zove kompetencija. Kompetentne ćelije mijenjaju svoj sastav ćelijski zid i plazmalema: zid postaje porozan, plazmalema stvara brojne invaginacije, a na vanjskoj površini se pojavljuju posebni antigeni - faktori kompetencije (posebno specifični proteini male molekularne težine).

U prirodnim uslovima, ekstracelularna čista DNK se formira tokom smrti (lize) prokariota.

Transformacija se po pravilu dešava unutar jedne vrste prokariota, ali u prisustvu homolognih gena uočava se i interspecifična transformacija.

Proces transformacije uključuje sljedeće faze:

1. Vezanje transformirane dvolančane DNK za receptore na površini ćelije primaoca.

2. Transformacija dvolančane DNK u jednolančanu.

3. Penetracija jednolančane DNK u ćeliju.

4. Integracija transformacije DNK u hromozom primaoca i rekombinacija genetskog materijala.

Dužina transformirajuće DNK trebala bi biti od 500 do 200 hiljada bp. Energija oslobođena tokom degradacije jednog od lanaca DNK koristi se za aktivni transport preostalog lanca u ćeliju.

Prve tri faze transformacije ne zavise od nukleotidnog sastava DNK. Međutim, verovatniji je proces integracije DNK koji se transformiše u hromozom primaoca ako je ova DNK visoko homologna sa DNK primaoca.

Proces transformacije je prikazan na dijagramu. Svaki segment linije odgovara jednom lancu DNK. DNK koja se transformiše je prikazana crnom, a DNK ćelije primaoca sivom.

U prvom koraku, transformirajuća DNK se veže za receptorska mjesta na površini ćelije primaoca.

U drugoj fazi, dvolančana DNK na površini ćelije se transformiše u jednolančanu DNK zbog cijepanja jedne od lanaca bakterijskim nukleazama.

U trećem koraku, preostali lanac DNK se transportuje preko membrane u citoplazmu. U ovom slučaju se koristi energija oslobođena tokom degradacije komplementarnog lanca.

Tokom replikacije bakterijskog hromozoma, transformirajući DNK lanac je vezan za homolognu (djelomično komplementarnu) DNK regiju ćelije primaoca. U ovom slučaju, zbog nedostatka potpune komplementarnosti, formira se heterodupleks ("molekularni heterozigot") - dio dvolančane DNK na kojem dušične baze nisu povezane vodikovim vezama u svim parovima nukleotida. Ostatak DNK se normalno replicira.

Nakon završetka replikacije DNK, stanica primateljica se dijeli i formira dvije ćelije: djelomično transformisanu ćeliju sa hromozomom koji uključuje heterodupleksnu DNK regiju i netransformisanu ćeliju. Tokom replikacije DNK u djelimično transformiranoj ćeliji, komplementarni lanci se dovršavaju na oba lanca DNK. Jedan lanac zadržava originalne nukleotidne sekvence, dok se drugi potpuno transformiše. Nakon diobe djelomično transformirane ćelije formiraju se jedna netransformisana ćelija i jedna potpuno transformisana ćelija, u kojima je originalna nukleotidna sekvenca zamenjena nukleotidnom sekvencom DNK koja se transformiše.

Tako se tokom transformacije geni primaoca zamjenjuju homolognim nukleotidnim sekvencama. Što je veći stepen homologije, to je transformacija uspešnija.

Učestalost transformacije kod prokariota ovisi o svojstvima transformirajuće DNK, o njenoj koncentraciji, o stanju stanice primaoca i o vrsti bakterije. Maksimalna učestalost transformiranih ćelija ne prelazi 1 na 100 ćelija.

Transformacija je poznata i za eukariote. Međutim, na površini eukariotskih ćelija nema receptorskih mjesta, a transformirajuća DNK se umjetno unosi u stanice. Na primjer, DNK se ubrizgava u životinjska jaja direktnom mikroinjektacijom, a u biljna jaja mikroinjektiranjem u polenovu cijev. Široko se koriste metode biobalistike (biolistika), koje omogućavaju unošenje bilo kakvih fragmenata DNK u kulture biljnog tkiva.

Konjugacija

Konjugacija kod prokariota je direktan kontakt dvije ćelije različitog kvaliteta, praćen barem djelomičnim prijenosom genetskog materijala iz ćelije donora u ćeliju primaoca. (Proces konjugacije su 1946. otkrili J. Lederberg i E. Tatum).

Kod E. coli, ćelija donor („muška“) ima duguljasti oblik, ćelija primaoca („ženska“) je izodijametrična. Ćelija donora formira genitalne resice (pili), koje je privlače u ćeliju primaoca i formiraju citoplazmatske kanale. Ovi kanali prenose DNK od ćelije donora do ćelije primaoca. Postoje tri tipa ćelija donora: F + (ef-plus), Hfr (h-ef-a) i F ′ (ef-prim).

F + -donori sadrže u citoplazmi polni faktor - specifični F-plazmid.

F-plazmid je samostalni replikon dugačak oko 100 kb. Više od 20 gena je proučavano u F-plazmidu. Otprilike polovina njih formira džinovski tra operon (dužine oko 30 kb); proizvodi ovog operona kontrolišu formiranje kontakta između donora i primaoca i stvarni transfer DNK. Drugi geni regulišu rad traoperona.

Ćelija primalac ne sadrži F-plazmid i označena je kao F-ćelija.

Kada se formira citoplazmatski most, jedan od lanaca F-plazmida se preseca u određenoj tački (tačka O) i počinje replikacija DNK na komplementarnom lancu po principu „kotrljajućeg prstena“. Kopija komplementarnog lanca prolazi kroz citoplazmatski most u citoplazmu ćelije primaoca i na njoj se dovršava nedostajući lanac. Nakon završetka replikacije, dvolančana plazmidna DNK se zatvara u prsten, a F - ćelija se pretvara u F + ćeliju. Ukupno vrijeme prijenosa kopije F-plazmida u ćeliju primatelja je približno 5 minuta.

Međutim, kada se ukršta F + × F –, samo geni sadržani u F– plazmid; geni za održavanje domaćinstva koji se nalaze na bakterijskom hromozomu ne prenose se u ćeliju primaoca.

Istovremeno, F-plazmid se može integrirati u bakterijski kromosom, odnosno ući u integrirano stanje. Postoji oko 20 mjesta integracije F-plazmida u bakterijskom hromozomu. Zatim, kada se kopija jednog od lanaca F-plazmida prenese u ćeliju primaoca, zajedno sa njom se nosi i kopija jednog od lanaca bakterijskog hromozoma. Ćelije s integriranim F-plazmidom nazivaju se Hfr-donori (od engleskog). visoka frekvencija rekombinacija"). Ovisno o uvjetima, moguć je potpun ili djelomičan prijenos kopije bakterijskog hromozoma Hfr-donora u citoplazmu primatelja. Kao rezultat, formira se stanica s jednim početnim dvolančanim bakterijskim hromozomom i jednom potpunom ili nekompletnom homolognom jednolančanom DNK molekulom. Takva ćelija se naziva merozigot ("parcijalni zigot"). Nadalje, tokom replikacije DNK dolazi do rekombinacije. Ovaj proces se suštinski ne razlikuje od rekombinacije tokom transformacije.

Transfer kopije DNK počinje približno od sredine F-plazmidne DNK (od tačke O, u kojoj je jedan od lanaca DNK zarezan i počinje replikacija DNK F-plazmida). Tako polovina F-plazmidne DNK ulazi u ćeliju primaoca na početku konjugacije, a druga polovina tek nakon potpunog prenosa kopije hromozomske DNK. Potrebno je više od 100 minuta da se ovaj proces završi pri t = 37 0 S. Međutim, u prirodnim uvjetima, konjugacija se prekida mnogo ranije; samo dio kopije hromozoma donora i samo prva polovina F-plazmidne DNK ulaze u ćeliju primaoca. Dakle, ćelija primalac ne preuzima svojstva Hfr donora.

Međutim, postoje sojevi bakterija kod kojih je kopija bakterijskog hromozoma, zajedno sa kopijom DNK F-plazmida, potpuno prenesena. Takve ćelije se nazivaju vHfr-donori (od engleskog: "Vrlo visoka frekvencija rekombinacije").

Vjerojatnost prijenosa određenog gena u ćeliju primaoca ovisi o njegovom uklanjanju iz F-plazmidne DNK, odnosno iz tačke O, u kojoj počinje replikacija DNK F-plazmida. Što je duže vrijeme konjugacije, veća je vjerovatnoća prijenosa datog gena. Ovo omogućava da se napravi genetska mapa bakterija za nekoliko minuta konjugacije. Na primjer, kod Escherichia coli, gen thr (operon od tri gena koji kontroliraju biosintezu treonina) nalazi se na nultoj tački (odnosno direktno pored F-plazmidne DNK), lac gen se prenosi nakon 8 minuta, gen recE nakon 30 minuta, gen argR - nakon 70 minuta itd.

F-plazmid se može prebaciti iz integriranog stanja u autonomno stanje samo-ekscizijom iz bakterijskog hromozoma. U ovom slučaju moguće je uhvatiti i dijelove hromozomske DNK (do 50% hromozomskih gena). F-plazmid, uključujući hromozomske gene, naziva se F′-faktor. Prenos genetskog materijala tokom F ′ × F ukrštanja naziva se seksdukcija.

Pored F-plazmida, kod prokariota su poznati i drugi tipovi polnih faktora (R, Ent, Hly, Col), koji obezbeđuju prenos genetskog materijala sa bakterije na bakteriju. Na osnovu prirodnih plazmida (uključujući DNK hloroplasta i mitohondrija) dobijeni su polusintetski molekuli DNK koji obezbeđuju prenos genetskog materijala iz jedne ćelije u drugu, zvani vektori. Vektori treba da obezbede ne samo stabilan transfer gena, već i regulaciju njihove transkripcije.

Prokariotski plazmidi mogu se replicirati samo u prokariotskim ćelijama. Istovremeno, postoji potreba za transferom gena sa eukariota na prokariote i obrnuto. Za to se koriste šatl plazmidi koji sadrže dva replikatora (prokariotski i eukariotski) i koji su sposobni da se repliciraju i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama, na primer, Ti- i Ri-plazmidi koji se mogu replicirati u prokariotskim i biljne ćelije, i polusintetičkih vektora baziranih na njima. Za zaštitu vektora od uništenja nukleazama, oni su zatvoreni u fosfolipidne vezikule - liposome.

transdukcija

Transdukcija je prijenos genetskog materijala virusima iz ćelije donora u ćeliju primaoca. (Fenomen transdukcije otkrio je 1951. N. Zinder (učenik J. Lederberga)).

Tokom transdukcije, DNK ćelije domaćina ulazi u virione. Virioni inficiraju druge ćelije, a DNK izvorne bakterijske ćelije ulazi u drugu bakterijsku ćeliju. Virusna DNK se integriše u bakterijski hromozom, a unesena bakterijska DNK se rekombinuje sa DNK bakterijskog hromozoma. Kao rezultat toga, 50% ćelija se transformiše.

Postoje opšta (nespecifična), ograničena (specifična) i abortivna transdukcija.

Opća transdukcija

U totalnoj transdukciji, fragmenti bakterijske DNK od donora se nasumično ugrađuju u sazrijevajuću česticu faga zajedno sa ili umjesto DNK faga. Fragmenti bakterijske DNK se formiraju kada je preseče enzim koji kontroliše fag. Čestica faga može uključivati ​​do 100 bakterijskih gena.

Ograničena transdukcija

S ograničenom transdukcijom dolazi do rekombinacije - bakterijska DNK zamjenjuje dio DNK faga. Rekombinantna DNK sadrži mali broj bakterijskih gena u blizini DNK faga integriranog u bakterijski hromozom.

Sa ukupnom i ograničenom transdukcijom, DNK donora zamjenjuje homologne regije DNK primaoca. Ovaj proces je sličan transformaciji.

Abortivna transdukcija može biti i nespecifična i specifična. Njegova suština leži u činjenici da fragment DNK koji transducira fag nije uključen u hromozom primaoca, već postoji kao citoplazmatski replikon. Prije ili kasnije, ovaj replikon se izgubi.

Fenomen transdukcije virusima se široko koristi u prijenosu gena kod eukariota. Ako se koristi virus koji nije u stanju da formira kapsid (odnosno, postoji samo u obliku DNK), tada se transdukcija ne razlikuje suštinski od transformacije ili od konjugativnog transfera genetskog materijala pomoću plazmidnih vektora. Vektorski sistemi su kreirani na osnovu modifikovanih virusa SV40 (formiraju do 100 hiljada kopija u ćeliji), virusa herpesa, vakcinije i mozaika karfiola.

Treba još jednom naglasiti da svi opisani tipovi rekombinacija nisu povezani sa dodatkom novih segmenata DNK, već sa zamjenom postojećih nukleotidnih sekvenci. Što je veći stepen homologije između transformisane i originalne DNK, veća je verovatnoća uspešne rekombinacije. Najlakši način je rekombinacija enzima prisutnih u svim organizmima. Teže je uvesti nove regulatore sa visokom specifičnošću u genom. Stoga se za uvođenje novih gena u genom koriste složenije metode povezane s biohemijskim modifikacijama DNK.

Tema 7: Citoplazmatsko nasljeđivanje . Genetika somatskih ćelija i tkiva.

1. Citoplazmatsko nasljeđivanje. Genetski materijal poluautonomnih organela. nasljeđivanje plastida. Nasljeđivanje preko mitohondrija. Citoplazmatski muški sterilitet

2. Posebne vrste nasljeđivanja. Predodređenje citoplazme. Nasljeđivanje putem infekcije i endosimbionta

3. Genetika somatskih ćelija. somatske mutacije. Himere. Genetika raka.

Tema: Genetika mikroorganizama 1. Konjugacija, transdukcija, transformacija. 2. Varijabilnost mikroorganizama. 3. Upotreba dostignuća u genetici bakterija.

Nasljedni aparat bakterija ima niz karakteristika: bakterije su haploidni organizmi, odnosno imaju 1 kromosom. S tim u vezi, kod nasljeđivanja osobina nema fenomena dominacije; Bakterije imaju visoku stopu reprodukcije, zbog čega se nekoliko desetina generacija bakterija zamjenjuje u kratkom vremenskom periodu (dan). Ovo omogućava proučavanje ogromnih populacija i lako identifikaciju čak i rijetkih mutacija. Nasljedni aparat bakterija predstavljen je hromozomom. Bakterije imaju samo jednu. Bakterijski hromozom je molekula DNK. Dužina ovog molekula dostiže 1,0 mm i, da bi se "uklopila" u bakterijsku ćeliju, nije linearna, kao kod eukariota, već je supernamotana u petlje i presavijena u prsten. Ovaj prsten je u jednom trenutku vezan za citoplazmatsku membranu. Pojedinačni geni se nalaze na bakterijskom hromozomu. U Escherichia coli, na primjer, ima ih više od 2 hiljade.

2. funkcionalne jedinice genom bakterija, pored hromozomskih gena, su: IS-sekvenca; transpozoni; plazmidi. IS-sekvencije (engleski insercija - umetanje, sekvenca - sekvenca) - kratki DNK fragmenti. Oni ne nose strukturne (kodiraju za određeni protein) gene, već sadrže samo gene odgovorne za transpoziciju (sposobnost IS sekvenci da se kreću duž hromozoma i integrišu u njegove različite regije). IS sekvence su iste za različite vrste bakterije. Transpozoni su molekule DNK veće od IS sekvenci. Osim gena odgovornih za transpoziciju, oni također sadrže strukturni gen koji kodira jednu ili drugu osobinu. Transpozoni (Tn-elementi) se sastoje od 2000-25000 parova baza, sadrže fragment DNK koji nosi specifične gene i dva terminalna IS elementa. Svaki transpozon obično sadrži gene koji daju karakteristike važne za bakteriju, kao što je višestruka otpornost na antibakterijske agense. Općenito, transpozone karakteriziraju isti geni kao i plazmidi (geni za otpornost na antibiotike, proizvodnju toksina, dodatni metabolički enzimi). Transpozoni se lako kreću duž hromozoma. Njihov položaj utiče na ekspresiju kako sopstvenih strukturnih gena tako i susednih hromozomskih gena. Transpozoni mogu postojati i izvan hromozoma,

Plazmidi su kružni supernamotani DNK molekuli. Njihova molekularna težina uvelike varira i može biti stotine puta veća od one transpozona. Plazmidi sadrže strukturne gene koji bakterijskoj ćeliji daju različita, za nju vrlo važna svojstva: R-plazmidi - otpornost na lijekove; Kol-plazmidi - sposobnost sinteze kolicina; F-plazmidi - za prijenos genetskih informacija; Tox-plazmidi - za sintetizaciju toksina; Biodegradacijski plazmidi - uništavaju jedan ili drugi supstrat itd. Plazmidi se mogu integrirati u hromozom (za razliku od IS sekvenci i transpozona, ugrađeni su u strogo određena područja), ili mogu postojati autonomno. U ovom slučaju imaju sposobnost autonomne replikacije i zato u ćeliji može biti 2, 4, 8 kopija takvog plazmida. Mnogi plazmidi sadrže gene za prenosivost i mogu se prenijeti iz jedne ćelije u drugu tokom konjugacije (razmjene genetskih informacija). Takvi plazmidi se nazivaju prenosivi.

Kod bakterija postoje 2 tipa varijabilnosti - fenotipska i genotipska. Fenotipska varijabilnost - modifikacija - ne utiče na genotip, ali utiče na većinu jedinki u populaciji. Modifikacije se ne nasljeđuju i blijede tokom vremena, tj. vraćaju se izvornom fenotipu nakon većeg (dugotrajne modifikacije) ili manjeg (kratkoročne modifikacije) broja generacija. h Genotipska varijabilnost utiče na genotip. Zasnovan je na mutacijama i rekombinacijama. Mutacije u bakterijama se suštinski ne razlikuju od mutacija u eukariotskim stanicama. Karakteristika mutacija u bakterijama je relativna lakoća njihovog otkrivanja, jer je moguće raditi s velikim populacijama bakterija. Po poreklu, mutacije mogu biti: spontane; inducirano. Po dužini: tačkasta; genetski; hromozomski. Po smjeru: ravno; - obrnuto.

Rekombinacija (razmjena genetskog materijala) kod bakterija se razlikuje od rekombinacije kod eukariota: bakterije imaju nekoliko mehanizama rekombinacije; prilikom rekombinacija u bakterijama ne nastaje zigot, kao kod eukariota, već merozigot (nosi kompletnu genetsku informaciju primaoca i dio genetske informacije donora u obliku suplementa); u bakterijskoj rekombinantnoj ćeliji ne mijenja se samo kvaliteta, već i količina genetskih informacija.

Konjugacija Kod bakterija, metoda prijenosa genetskog materijala iz jedne bakterijske ćelije u drugu. U ovom slučaju dvije bakterije su povezane tankim mostom, kroz koji dio lanca deoksiribonukleinske kiseline (DNK) prelazi od jedne ćelije (donora) do druge (primaoca). Nasljedna svojstva primatelja mijenjaju se u skladu s količinom genetskih informacija sadržanih u prenesenom dijelu DNK.

Konjugacija Konjugacija (od lat. conjugatio - veza), paraseksualni proces - jednosmjerni prijenos dijela genetskog materijala (plazmidi, bakterijski hromozom) uz direktan kontakt dvije bakterijske ćelije. Otvoren 1946. od strane J. Lederberga i E. Taitema. U prirodi je od velike važnosti, jer podstiče razmjenu korisnih osobina u nedostatku pravog seksualnog procesa. Od svih procesa horizontalnog transfera gena, konjugacija omogućava prijenos najveće količine genetskih informacija.

Konjugacija je razmjena genetskih informacija u bakterijama prenošenjem sa donora na primatelja tokom njihovog direktnog kontakta. Nakon formiranja konjugacionog mosta između donora i primaoca, jedan lanac DNK donora kroz njega ulazi u ćeliju primaoca. Što je kontakt duži, to večina DNK donora se može prenijeti na primaoca. Na osnovu prekida konjugacije u određenim intervalima moguće je odrediti redosled gena na hromozomu bakterije – izgraditi hromozomske mape bakterija (mapirati bakterije). F+-ćelije imaju funkciju donora.

Transdukcija Esther Lederberg je uspjela da izoluje bakteriofag lambda, DNK virus, iz Escherichia coli K 12 1950. godine. Stvarno otkriće transdukcije povezano je s imenom Joshue Lederberga. 1952. godine, zajedno sa Nortonom Zinderom, otkrili su totalnu transdukciju. Godine 1953. Lederberg i saradnici su pokazali postojanje abortivne transdukcije, a 1956. specifične transdukcije.

Transdukcija je razmjena genetskih informacija u bakterijama prijenosom od donora do primatelja uz pomoć umjerenih (transducirajućih) bakteriofaga. Transducirajući fagi mogu nositi 1 ili više gena (osobina). Transdukcija se dešava: specifično - uvek se prenosi isti gen; nespecifični - prenose se različiti geni. To je zbog lokalizacije transducirajućih faga u genomu donora: u slučaju specifične transdukcije, oni se uvijek nalaze na istom mjestu na hromozomu; kod nespecifičnih njihova lokalizacija je promjenjiva.

Rice. 2. Transdukcija 1 - bakterija - donor (B+), 2 - fag, 3 - reprodukcija, 4 - adsorpcija, 5 - bakterija - primalac (B-), 6 - bakterija - primalac sa novim svojstvom.

Transformacija je razmjena genetskih informacija u bakterijama uvođenjem primatelja u bakterijsku ćeliju gotov proizvod DNK (posebno pripremljena ili direktno izolirana iz ćelije donora). Najčešće se prijenos genetskih informacija događa kada se primalac uzgaja na hranljivoj podlozi koja sadrži DNK donora. Za percepciju donora DNK tokom transformacije, ćelija primaoca mora biti u određenoj fiziološko stanje(kompetentnost), koja se postiže posebnim metodama obrade bakterijske populacije ili se javlja spontano. Tokom transformacije, prenose se pojedinačni (obično 1) znakovi. Transformacija je najobjektivniji dokaz povezanosti DNK ili njenih fragmenata sa jednom ili drugom fenotipskom osobinom, budući da se čisti DNK preparat unosi u ćeliju primaoca.

Rice. 3. Transformacija kapsularnog soja bakterija (1) tokom sjetve daje rast (6). Nakon prokuvavanja ove kulture nema rasta (7). Rezultat takvog eksperimenta sa sojem bez kapsule (4 -rast +, 8 -rast -) je sličan. Kombinovanjem u jednom kontejneru ekstrakta manioke (1) i žive kulture nekapsularnih (3) sojeva, nakon čega sledi zasijavanje, daje se rast kapsularnog soja (5).

Osobine ćelija kolonija S- i R-oblika S-oblika R-oblika Kolonije su hrapave, neprozirne sa neravnim ivicama, često naborane Flagele često odsutne Kapsule ili mukozni sloj je odsutan Biohemijski manje aktivan Slabo virulentan ili avirulentan Antigenski defektan Slabo osjetljiv na fag Suspenzija se brzo taloži, mrvičast sediment, polimorfne ćelije Kolonije prozirne, sa glatkom sjajnom površinom, okrugle, sa glatkim ivicama, konveksne Pokretne vrste imaju bičeve Kapsularne vrste imaju jasno vidljivu kapsulu ili mukozni sloj Biohemijski aktivnije Virulentna svojstva su izražena kod patogenih vrsta Antigenalno potpuna Osetljiva na fag Suspenzija ćelija u fiziološki rastvor homogene, stabilne ćelije normalne veličine

Genetske rekombinacije- preraspodjela genetskog materijala roditelja u potomstvu, što određuje kombinativnu varijabilnost organizama. Nastaju uz učešće enzima unutar pojedinih gena.

konjugacija - prijenos genetskog materijala iz ćelije donora u ćeliju primaoca kroz bliski kontakt. Donori genetskog materijala su ćelije koje nose F-plazmid. Bakterijske ćelije kojima nedostaje F-plazmid su primaoci.

Prva faza konjugacije je vezivanje ćelije donora za primaoca pomoću genitalnih resica. Između ćelija formira se konjugacioni most preko kojeg se F-plazmid prenosi iz ćelije donora u ćeliju primaoca.

Ako se F-plazmid ubaci u hromozom bakterije, jedan lanac DNK puca uz učešće endonukleaze. Proksimalni kraj DNK prodire u ćeliju primaoca kroz konjugacijski most i odmah se dovršava u dvolančanu strukturu. Preostala nit u ćeliji donora je matrica za sintezu druge niti.

Transformacija- direktan transfer genetskog materijala donora u ćeliju primaoca. Transformacija se efektivno dešava samo između bakterija iste vrste sa različitim genotipovima.

Ćelije koje mogu prihvatiti DNK donora nazivaju se kompetentnim. Stanje kompetentnosti nastaje tokom rasta ćelije i poklapa se sa završetkom logaritamske faze.

Dvolančani DNK fragmenti sa molekulskom težinom od najmanje 0,5-1x10 6 imaju transformirajuću aktivnost

Proces transformacije se sastoji od faza:

1) adsorpcija DNK donora na ćeliji primaoca,

2) prodiranje DNK u ćeliju primaoca uz naknadnu despiralizaciju,

3) povezivanje jednog lanca DNK sa homolognim regionom hromozoma primaoca.

transdukcija - prijenos genetskog materijala s jedne bakterije na drugu pomoću faga. razlikovati:

1) nespecifična transdukcija– kada se bilo koji gen donora prenese u ćeliju primaoca zajedno sa DNK faga. Fragment DNK bakterije donora koji je prenio fag može se rekombinacijom ugraditi u homologni DNK region ćelije primaoca. Transducirajući fag je samo prenosilac genetskog materijala od jedne bakterije do druge, a sama DNK faga ne sudjeluje u stvaranju rekombinanta,

2) specifična transdukcija. fag prenosi specifične gene sa bakterije donora na bakteriju primaoca. Kada transdukcioni fagi stupaju u interakciju sa ćelijama soja primaoca, gen bakterije donora se zajedno sa DNK defektnog faga ugrađuje u hromozom bakterije primaoca.

3) neuspješan- kada fragment DNK bakterije donora koju donosi fag nije uključen u hromozom bakterije primaoca, već se nalazi u njenoj citoplazmi i može funkcionirati u ovom obliku. Tokom diobe rekombinantne bakterijske ćelije, donijeti fragment DNK donora prenosi se samo u jednu od kćeri ćelija i vremenom nestaje.

Tema 6: Doktrina infekcije. Hemoterapeutski lijekovi. Antibiotici.

Pitanja za samostalno učenje:

1. Infekcija. Uslovi za nastanak i načini prenošenja patogena.

2. Oblici infekcije i njihove karakteristike.

3. Periodi zarazne bolesti.

4. Karakterizacija bakterijskih toksina.

5. Antibiotici: klasifikacija, upotreba, komplikacije pri uzimanju antibiotika.

6. Metode za određivanje osjetljivosti mikroorganizama na antibiotike.

7. Najvažnije grupe kemoterapeutskih lijekova i njihovi mehanizmi djelovanja.

Teorijski materijal za samoobuku :

Dodano: 03.09.2015 | Pregledi: 888 | Kršenje autorskih prava