Sistem međućelijske komunikacije u mikroorganizmima naziva se sistem quorum sensing (QS ). Danas se QS sistem definiše kao sistem koordinisane ekspresije gena u populaciji, u zavisnosti od njenog indeksa gustine, koristeći male signalne molekule. Kao što je gore navedeno, ovaj mehanizam je prvi put opisao Nilson 1970. u morskoj bakteriji. Vibrio fisheri kao sistem regulacije bioluminiscencije. U početku se pretpostavljalo da je ovaj regulatorni mehanizam karakterističan za samo mali broj blisko povezanih vrsta roda Vibrio, međutim, daljnje studije su pokazale široku rasprostranjenost ovog regulatornog mehanizma u svijetu mikroorganizama. Utvrđeno je da uz pomoć QS sistema mikroorganizmi mogu regulisati mnoge životne procese, posebno patogenost, sekundarni metabolizam, stvaranje biofilma i još mnogo toga. Pokazalo se da se QS sistem nalazi ne samo kod bakterija, već i kod nekih nižih eukariota, kao što su gljive nalik kvascu iz rodova Candida I Cryptococcus. Štaviše, pokazalo se da uz pomoć ovog sistema mikroorganizmi mogu komunicirati ne samo sa svojom vrstom, već i za obavljanje međuregionalne komunikacije, uključujući i više eukariote.

Uopšteno govoreći, funkcionisanje QS sistema se zasniva na nizu ključnih principa (slika 11):

1. Upotreba malih signalnih molekula - u sistemu QS, prijenos signala iz jedne ćelije u drugu vrši se pomoću signalnih molekula različite hemijske prirode.

2. Prisustvo specifičnih receptora – signalnih molekula ne utiču direktno na ekspresiju ciljnih gena. Aktivacija ciljnih gena nastaje tek nakon vezivanja signalnih molekula za odgovarajuće receptore.

3. Uticaj gustine ćelijske populacije – QS sistem se pokreće tek nakon dostizanja određene vrednosti gustine ćelijske populacije, koja je u korelaciji sa koncentracijom signalnih molekula u okruženju.

4. Samoodržavanje funkcionisanja – kontrola sinteze novih signalnih molekula i receptora vrši se na isti način kao i kod ciljnih gena u odsustvu aktivacije sistema represije.

5. Prisustvo mehanizama selektivne negativne regulacije – u ćelijama mikroorganizama postoje i zavisni i nezavisni od QS geni negativne regulacije, čiji su proizvodi u stanju da selektivno isključuju čitave karike QS sistema ili čitav sistem kao cjelina.

Rice. 11. Opća shema funkcionisanja kvorum sensing sistema.

Ovi principi su zajednički za gotovo sve tipove QS sistema, bez obzira na njihovu specifičnu strukturnu organizaciju. Početak QS sistema obično se poklapa sa ranom fazom eksponencijalnog rasta, koju karakteriše brz porast gustine stanične populacije. Ekspresija ciljnih gena, naprotiv, obično počinje izlaskom stanične populacije u stacionarnu fazu i obično je složena, odnosno podrazumijeva početak biosinteze gotovo svih QS-reguliranih proizvoda u kratkom periodu od vrijeme. Dakle, rane faze QS sistema treba da osiguraju biosintezu signalnih molekula i njihovih receptora, do određene tačke, koja se poklapa sa akumulacijom maksimalna koncentracija signalnih molekula u međućelijskom prostoru, po dostizanju kojih rad QS sistema prelazi u samoodrživo stanje.

Mehanizmi koji stoje u osnovi ranog aktiviranja QS sistema još nisu u potpunosti razjašnjeni. Uprkos činjenici da je otkriven veliki broj različitih regulatora, kojima se pripisuje određena uloga u ranom aktiviranju sistema, mnoga pitanja ostaju nerazjašnjena. Prije svega, nije jasno kako je regulirano primarno nakupljanje signalnih molekula i njihovih receptora. Postoji hipoteza da je određeni broj signalnih molekula i receptora za njih stalno prisutan u ćelijama, a njihova primarna akumulacija se odvija po istom samoodrživom mehanizmu, dok se dio unutarćelijskog pula ovih spojeva troši na sintezu signalnih molekula i receptora. Ostatak se izlučuje iz ćelija i, kada dostigne graničnu koncentraciju, ponovo se apsorbuje i pokreće ekspresiju ciljnih gena. Međutim, na osnovu karakteristika funkcionisanja nekih tipova QS sistema, to se čini malo verovatnim. James P. Pearson, naprotiv, smatra da se početno lansiranje QS-a vrši uz pomoć nespecifičnih regulatora transkripcije kao npr. MvaT I Vfr (V irulencija f glumci r regulator) Pseudomonas aeruginosa, a sistem mnogo kasnije prelazi u samoodrživo stanje.

"Antibiotici i kemoterapija", 2003, 48 (10): 32-39.

Članak je objavljen uz ljubaznu dozvolu Olge Efremenkove
Vladimirovna, glava sektor pretraživanja prirodna jedinjenja
Istraživački institut za otkriće novih antibiotika im. G.F. Gause RAMS

Komunikativni signali bakterija

V.D. Gruzijski

Istraživački institut za otkrivanje novih antibiotika. G. F. Gause RAMS, Moskva

V.D. Georgia. Komunikativni signali bakterija

G.F. Institut za nove antibiotike Gause, Ruska akademija medicinskih nauka, Moskva

Trenutno postoji tranzicija sa tradicionalne ideje o bakterijama kao strogo jednoćelijskim organizmima na ideju o mikrobnim zajednicama kao integralnim strukturama koje regulišu svoje bihejvioralne odgovore u zavisnosti od promena uslova okoline.

Kolonije gotovo svih vrsta bakterija pokazuju sposobnost diferencijacije stanica i višećelijske organizacije. Ova sposobnost je najočitija kada bakterije rastu u svojim prirodnim staništima, gdje formiraju različite višećelijske strukture: biofilmove, bakterijske prostirke, plodna tijela itd.

Koncept Quorum Sensinga predstavljen je 1994. godine. To znači percepciju ćelija promjena u okolišu koje nastaju kada bakterijska kultura dostigne određeni granični broj i reakciju na te promjene.

Opisani procesi koji se javljaju samo pri dovoljno velikoj gustoći naseljenosti uključuju sljedeće pojave:

• bioluminiscencija u morskim bakterijama Vibrio fisheri I V.harveyi;
• agregacija ćelija miksobakterije i naknadno formiranje plodišta sa sporama;
• sporulacija u bacilima i aktinomicetama;
• stimulacija rasta streptokoka i niza drugih mikroorganizama;
• konjugacija prijenosa plazmida Enterococcus faecalis i srodne vrste, kao i bakterije iz roda Agrobacterium;
• sinteza egzoenzima i drugih faktora virulencije u biljnim patogenima ( Erwinia carotovora, E.hyacinthii itd.) i životinje ( Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);
• formiranje antibiotika kod pripadnika roda Streptomyces i na E. carotovora;
• formiranje biofilma u R. aeruginosa i drugih mikroorganizama.

Razotkriveni su mehanizmi mnogih od ovih procesa, utvrđeni međućelijski komunikacijski faktori odgovorni za procese u zavisnosti od gustine naseljenosti.

Ozbiljan problem u kliničkoj praksi je rasprostranjena pojava rezistentnih oblika mikroorganizama, što smanjuje efikasnost upotrebe antibakterijskih lijekova. Posebnu poteškoću predstavlja povećana otpornost bakterija na lijekove u biofilmima. Bakterije često koriste reakcije kvoruma da bi sintetizirale faktore virulencije, antibiotike i formirale biofilmove. Stoga, proučavanje mehanizama ovakvih reakcija otvara nove mogućnosti za prevenciju i liječenje bolesti uzrokovanih mikrobnim agensima, a također omogućava drugačiji pogled na složeni kompleks međuvrsnih interakcija bakterija u prirodnim staništima mikroorganizama.

Mehanizmi reakcija sensinga kvoruma razlikuju se kod Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija, pa ih je preporučljivo razmotriti odvojeno.

Reakcije čula kvoruma u gram-pozitivnim mikroorganizmima

Gram-pozitivne bakterije obično komuniciraju koristeći oligopeptidne signalne molekule. Signalizacija u većini slučajeva uključuje dvokomponentni mehanizam fosforilacije. Po pravilu, stanje kvoruma se postiže kada populacija bakterijskih ćelija uđe u stacionarnu fazu rasta. U tom trenutku se detektiraju signalni molekuli, uz pomoć kojih stanice međusobno kontaktiraju. Opća shema komunikacije gram-pozitivnih bakterija može se predstaviti na sljedeći način: prvo, u ćeliji se sintetizira prekursor, koji se modificirajući pretvara u zreli oligopeptid. Ovo drugo izvoznik izlučuje izvan ćelije. Molekuli oligopeptida se akumuliraju u međućelijskom prostoru kako se povećava gustina bakterijskih ćelija. Dvokomponentna senzorna kinaza koja se proteže kroz membranu prepoznaje signal i prenosi ga u ćeliju kroz kaskadu fosforilacije. U ćeliji, molekul oligopeptida stupa u interakciju sa ciljnim genom(ima).

Klasični sistem zavisan od kvoruma peptida može se smatrati sistemom odgovornim za konjugativni prijenos plazmida u Enterococcus faecalis i srodne bakterijske vrste. Ovaj sistem stimuliše distribuciju u mikrobnoj populaciji osobina važnih za interakciju mikroorganizma i životinje domaćina, kao i za eliminaciju konkurencije. Plazmid pPDl nošen peptidnim kvorumom zavisnim sistemom odgovoran je za sintezu hemolizina, plazmid pCDl je odgovoran za stvaranje bakteriocina, plazmid pCFlO je odgovoran za rezistenciju E.faecalis na tetraciklin. Svaki heksa- ili okta-peptid indukuje adheziju bakterijskih ćelija i njihovu konjugaciju sa transferom specifičnog plazmida sa donora na primaoca. Na primjer, cPDl oktapeptid stimulira konjugativni prijenos pPDl plazmida. Plazmid kodira receptor koji se nalazi na represorskom proteinu odgovarajućeg operona. Interakcija oligopeptida sa receptorom uzrokuje disocijaciju represora od DNK, čime se pokreće sinteza odgovarajućeg proizvoda. PPDl plazmid također uključuje traC gen, čiji je proizvod protein koji olakšava prodiranje peptida kroz ćelijski zid. Oligopeptidne signale intenzivno sintetiziraju ćelije koje ne nose odgovarajuće plazmide (primaoce), dok je sinteza takvih signala potisnuta u donorskim ćelijama, štoviše, plazmid kodira inhibitorni peptid.

Produkt plazmida pPDl je iPDl peptid, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Još jedan proces ovisan o kvorumu pronađen u E.faecalis, je proizvodnja dva faktora virulencije: želatinaze (GelE) i serin proteaze (SprE).

Primer upotrebe peptidnog signala za međućelijske interakcije je kvorum senzorski sistem, koji kontroliše sintezu egzotoksina u kasnoj logaritamskoj fazi rasta u Staphylococcus aureus. U ovom sistemu, AgrD protein se sintetiše kao prekursor koji se sastoji od 46 aminokiselina, koji se tokom izvoza AgrB proteinom pretvaraju u zreli AIP (autoinducirajući peptid) koji se sastoji od 8 aminokiselina. AIP prepoznaje dvokomponentna senzorska kinaza AgrC, koja prenosi signal u ćeliju tokom fosforilacije regulatora odgovora, AgrA. AgrA~P aktivira transkripciju ciljnih gena, stimuliše transkripciju agrB, D, C, A operona (pozitivna autoregulaciona petlja), a takođe „zabranjuje“ transkripciju gena koji kodiraju druge egzotoksine. Na osnovu razlika u AIP-u i njegovom receptoru, sojevi S. aureus može se dodijeliti u četiri ili više grupa. Oligopeptidi koje sintetiše jedna od grupa izazivaju patogenost u ovoj grupi i specifično potiskuju Agr-virulentne sisteme u drugim grupama.

Pojava kompetencije u kasnoj logaritamskoj fazi rasta zavisi od gustine naseljenosti. Streptococcus pneumoniae. comC gen kodira prekursor koji se sastoji od 41 aminokiselinskog ostatka. Potonji se pretvara u zreli peptid koji se sastoji od 17 aminokiselinskih ostataka u procesu interakcije sa sistemom za izvoz peptida (ABC sistem), koji je formiran od proizvoda comAB gena. Peptid dolazi u kontakt sa svojim receptorom na površini ćelije, histidin kinazom, proizvodom comD gena. Aktivirana histidin kinaza fosforilira proizvod comE gena. Kako se ćelije akumuliraju, broj peptidnih signala se povećava i dostiže kritični nivo u mediju. Shodno tome, povećava se i količina fosforiliranog comE proteina, koji se, počevši od određene koncentracije, vezuje za promotor comCDE operona, stimulirajući njegov rad (pozitivna autoregulaciona petlja), aktivira promotor comAB operona (sistem za izvoz proteina iz ćelije) , aktivira comX operon, koji uključuje cijeli lanac kasnih kompetentnih gena; odgovoran za vezivanje i apsorpciju transformirajuće DNK i svih ostalih, kasnih faza transformacije.

Pored gore navedenih primjera reakcija kvoruma kod gram-pozitivnih bakterija, treba napomenuti da, osim oligopeptida, gram-pozitivne bakterije također koriste tvari različite kemijske prirode kao signalne molekule. Dakle, predstavnici reda Actinomycetales Uz signalne molekule peptida pronađene su tvari niskomolekularne prirode, od kojih većina sadrži laktonsku grupu.

Kod streptomiceta, sistemi quorum sensing uključuju butirolaktone i njihove odgovarajuće proteinske receptore, koji zajedno regulišu morfološki razvoj i proizvodnju antibiotika u njihovim proizvođačima. Najdobro proučavan regulator aktinomiceta je A-faktor, koji je 2-izo-kapriloil-3-hidroksimetil-y-butirolakton.

Utjecaj A-faktora na morfološko diferencijaciju i stvaranje antibiotika podliježe općoj shemi rada regulatora streptomiceta koji sadrže laktonsku grupu. U ranim fazama rasta, kada je koncentracija A-faktora niska, receptor A-faktora (AgrA) se vezuje za i potiskuje ekspresiju hipotetičkog zajedničkog aktivatora biosinteze i sporulacije streptomicina. Izolacija AgrA iz ćelijskog lizata S. griseus Pokazalo se da je IFO 13350 protein od 276 aminokiselina s molekulskom težinom od 29,1 kDa.

Kako se gustina kulture povećava, koncentracija faktora A dostiže kritični nivo na kojem veže AgrA, uzrokujući odvajanje potonjeg od DNK i na taj način uključuje transkripciju ključnog gena za adpA koji kodira AdpA (protein od 405 aminokiselina koji sadrži vezujući mesto u centralnom regionu). sa DNK, slično kao regulatori transkripcije iz porodice proteina AraC/XylS). AdpA je, pak, pozitivan regulator otkrivenog citoplazmatskog aktivatora klastera gena biosinteze streptomicina i aktivatora procesa sporulacije. Citoplazmatski aktivator, vezujući se za DNK u regionu promotora gena za specifičnu regulaciju strR strR klastera biosinteze streptomicina, indukuje transkripciju ovog gena, gena za otpornost na sopstveni antibiotik, aphD, koji se nalazi iza njega, gen adsA, koji kodira ekstracitoplazmatski a-faktor RNA polimeraze, neophodan za formiranje zračnog micelija, kao i gen sgmA koji kodira protein peptidaze, koji zajedno s drugim hidrolitičkim enzimima učestvuje u razgradnji proteini supstrata micelija kao rezultat formiranja zračnog micelija. Regulatorni proizvod strR gena određuje početak transkripcije gena strukturne biosinteze kao dijela klastera StrR zavisnih promotora. Početak ekspresije iz promotora strR gena pod uticajem citoplazmatskog aktivatora takođe obezbeđuje proizvodnju aphD genskog produkta, aminoglikozid fosfotransferaze, a time i stvaranje osnovnog nivoa rezistencije soja na sopstveni antibiotik.

Pokazano je da različite vrste streptomiceti su uočili homologiju između strukturnih elemenata regulatora. Nukleotidne sekvence homologne agrA genu u S. griseus, nalaze se i kod drugih streptomiceta. Na primjer, kod S.coelicolor A3 (2), pronađena su dva gena srA i srB, koji kodiraju AgrA-slične proteine ​​CrA i CrB, koji su 90,7% slični jedni drugima i 35% AgrA.

Reakcije sensinga kvoruma kod gram-negativnih mikroorganizama

U više od 450 vrsta gram-negativnih bakterija pronađeni su kvorum-ovisni sistemi u kojima različiti acilhomoserinski laktoni služe kao signalni molekuli. Opšta šema komunikacije u Gram-negativnim bakterijama može se predstaviti na sljedeći način: u kvorum-sensing sistemu Gram-negativnih bakterija, proteini porodice Luxl su autoinduktorske sintaze i katalizuju formiranje specifičnih acil homoserin lakton autoinduktorskih molekula. Autoinduktori slobodno difundiraju kroz membranu i akumuliraju se kako se gustoća stanica povećava. Proteini iz porodice LuxR vezuju srodne autoinduktore kada se postigne dovoljno visoka koncentracija signalnih molekula. LuxR kompleks, autoinduktor, vezuje se za promotor ciljnih gena, započinjući njihovu transkripciju.

Bakterije iz roda Erwinia (E. carotovora, E. chrysanthemii) su biljni patogeni. Uz pomoć pektinaza i celulaza razgrađuju zidove biljnih stanica. Formiranje ovih enzima je važan faktor virulencije i zavisi od gustine populacije. At Erwinia expI-expR genski sistem funkcioniše, slično luxI-luxR sistemu u V.fisheri. Reakcije sensinga kvoruma takođe uključuju regulatorni sistem obezbeđen transkripcijom rsmA-rsmB gena. Od gustine naseljenosti E. carotovora takođe zavisi od sinteze antibiotika karbapenema. Proizvodnja ovog antibiotika je pod kontrolom klastera gena carA-carH i može biti neophodna za eliminaciju konkurentskih mikroorganizama na mestu infekcije biljke.

Prikazan je još jedan primjer upotrebe homoserinskih laktona kao signalnih molekula Pseudomonas aeruginosa- patogen za životinje. Patogenost u R. aeruginosa zbog širokog arsenala faktora virulencije. Neki od njih su povezani sa ćelijom (pili, adhezini, lipopolisaharidi), drugi se luče (proteaze, ramnolipidi, egzoenzim S, egzotoksin A, antibiotik piocijanin itd.). Formiranje mnogih faktora ekstracelularne virulencije kontrolišu sistemi međućelijske interakcije. Centralne komponente takvih interakcija su sensing sistemi las i rhl quorum, koji aktiviraju ekspresiju gena u zavisnosti od gustine ćelija mikroorganizma. Svaki sistem je predstavljen sa dva gena: jedan kodira enzim koji sintetiše specifični autoinduktor - acilirani homoserin lakton (lasl/rhll); drugi kodira aktivator transkripcije za koji se vezuje odgovarajući autoinduktor (lasR/rhIR). Autoinduktor las i rhi sistema je N-(3-oksododekanoil)-L-homoserin lakton (3-okso-C12-HSL), koji se iz ćelije izvozi posebnim sistemom zvanim MexEF-OprN-pumpa i N- butiril-L- homoserin lakton (C4-HSL), respektivno.

Las sistem kontroliše ekspresiju gena koji kodiraju faktore virulencije kao što su elastaza A, B i alkalna proteaza; rhi sistem - enzimi za biosintezu ramnolipida, piocijanin. Nedavno je otkrivena treća signalna molekula koja je uključena u reakcije kvoruma u P.aeruginosa- 2-heptil-3-hidroksi-4-kinolon (PQS). Ovaj signalni molekul može kontrolisati nivo ekspresije las B, koji kodira Las B elastazu, kao i nivo ekspresije rhil, koji kodira C4-HSL sintazu.

Bakterija Agrobacterium tumefaciens uzrokuje stvaranje krunskih žuči kod mnogih biljnih vrsta. Žuči su biljni analog malignog tumora i nastaju kao rezultat prijenosa onkogenih fragmenata DNK iz bakterije u jezgro biljne stanice pomoću Ti-plazmida. Neki od gena Ti-plazmida određuju sintezu opina u biljnim stanicama, koji služe kao hranjivi supstrat za A.tumefaciens. LuxI-luxR homologni traI-traR genski sistem stimuliše širenje Ti plazmida u populaciji bakterija. Plazmidna DNK ima tendenciju proliferacije u bakterijskoj populaciji i, kada se stvori dovoljan "kvorum", inducira ćelije koje nose plazmid da se konjugiraju s drugim bakterijskim stanicama. Istovremeno, konjugativni transfer Ti-plazmida zavisi od opina. Konkretno, traR transkripciju stimuliše OccR faktor aktiviran oktopinom.

Osjećanje kvoruma u višećelijskim formacijama

Sposobnost bakterija da formiraju biofilm zanimljiva je s obzirom na činjenicu da predstavnici patogena patogenih za ljude i životinje pokazuju otpornost na djelovanje antimikrobnih tvari kada rastu u biofilmovima. Biofilmovi su visoko uređene bakterijske zajednice koje omogućavaju bakterijama da žive u vezanom stanju. Biofilmovi mogu biti sastavljeni od jedne ili više vrsta bakterija. Oni su prožeti mrežom vodenih kanala koji osiguravaju isporuku hranljive materiječlanovi zajednice i uklanjanje metaboličkih proizvoda. Unutar jednog biofilma mogu se uočiti različiti obrasci ekspresije gena, što sugerira da pojedini članovi zajednice imaju "specifične odgovornosti" koje, u kombinaciji s drugima, povećavaju održivost cijelog konzorcija.

Biofilmovi se formiraju u plućima uz pomoć patogena P.aeruginosa. Debljina takvog biofilma je nekoliko stotina mikrometara. Mikrokolonije u zrelom biofilmu nalaze se u ekstracelularnom polisaharidnom matriksu. Unutar biofilma nalazi se heterogenost: u njemu postoji gradijent kisika - smanjenje koncentracije kisika od periferije prema unutra. Očekuje se da će se slični gradijenti naći za pH i nutrijente. Ovi gradijenti pružaju fiziološku varijabilnost među pojedinačnim ćelijama biofilma: na primjer, stanice rastu mnogo sporije u dubini nego na periferiji. Bakterija u tako zrelom biofilmu je fenotipski otporna na baktericidne agense. Dakle, biofilmovi uzrokuju različite vrste kroničnih bakterijske infekcije. Formiranje biofilma u P.aeruginosa je pod kontrolom reakcija kvoruma. Mutacije u genu lasI ometaju sazrijevanje biofilma, jer LasI protein ne sintetizira 3-okso-C12-HSL, a formiranje mikrofilma se ne nastavlja nakon faze mikrokolonije. Uloga C4-HSL u procesima formiranja ostaje nepoznata. Biofilmovi formirani od mutanta LasI proteina su osjetljivi na deterdžente, dok su normalni biofilmi otporni. To daje razloga da se misli da je terapija usmjerena na disregulaciju kvorum-sensing mehanizma u P.aeruginosa, može dovesti do zaustavljanja stvaranja biofilma, što će povećati osjetljivost ove bakterije na antimikrobna sredstva.

Formiranje biofilma u patogenoj bakteriji Burkholderia cepacia također definiran "osjećajem kvoruma". Kada raste u biofilmovima, ovaj mikroorganizam je sličan P.aeruginosa pokazuje značajnu otpornost na antimikrobna sredstva.

Interspecifične interakcije mikroorganizama

Interspecifične komunikacije u bakterijama mogu poslužiti za sinkronizaciju specijaliziranih funkcija vrsta u grupi. Raznolikost prisutna u bilo kojoj populaciji može poboljšati opstanak cijele zajednice. Štaviše, produktivne interakcije zasnovane na quorum sensingu mogu promovirati razvoj viševrstnih bakterijskih organizacija, kao što su biofilmi, kao i uspostavljanje specifičnih simbiotskih asocijacija s eukariotskim domaćinima.

Međuvrsne interakcije mikroorganizama najpotpunije su proučavane na primjeru mikrobne zajednice. usnoj šupljini i površine ljudskih zuba. Oko 500 vrsta bakterija je identificirano u biofilmovima na površini zuba, koji funkcioniraju kao koordinirana zajednica s intra- i interspecifičnim komunikacijama. Streptokoki čine 60 do 90% bakterija koje koloniziraju površinu zuba tokom prva četiri sata nakon što ih stomatolog očisti. Među ostalim vrstama "ranih kolonizatora" nalaze se predstavnici Actinomyces, Capnocytophaga, Eikenella, Haemophilus, Prevotella, Propionibacterium I Veillonella.

Načini komunikacije između genetski identičnih ćelija vjerovatno će se razlikovati od signala u komunikaciji među vrstama. Nema dokaza o oralnim bakterijama među signalnim molekulima tipični predstavnici porodice acilhomoserinskih laktona koji regulišu intraspecifičnu ekspresiju gena u gram-negativnim bakterijama.

AI-2 je glavni signalni molekul u interspecifičnim komunikacijama. To potvrđuje i otkriće luxS gena koji kodira enzim neophodan za sintezu molekule AI-2 u nekoliko rodova oralnih bakterija.

AI-2 je prvi put otkriven u morskoj svjetlećoj bakteriji Vibrio harveyi, za koji je signalna molekula koja reguliše proces bioluminiscencije. Kasnije se prisustvo AI-2 pokazalo u više od 30 vrsta bakterija, uključujući gram-pozitivne i gram-negativne mikroorganizme.

Ponekad može biti korisno da jedna grupa bakterija negativno utiče na ciklus otkrivanja kvoruma konkurentske grupe bakterija. Istraživanja u ovoj oblasti otkrivaju nekoliko primjera strategija antiquorum sensinga koje koriste koegzistirajuće bakterijske populacije. dakle, Staphylococcus epidermidis koristi peptid za kontrolu nivoa njegove agr virulencije, kao i za suzbijanje virulencije u Staphylococcus aureus.

Procijedite bacil sp. 240B1 pokazuje sposobnost enzimske inaktivacije acilhomoserinskih laktona, signalnih molekula gram-negativnih bakterija. Pokazalo se da se u prisustvu AIA, homoserin laktonaze, koja se sastoji od 250 aminokiselina, uništavaju molekuli homoserin laktona koje stvara patogen u biljkama. Erwinia carotovora. Geni homologni genu aiiA takođe su pronađeni u 16 podvrsta Bacillus thuringiensis stoga su ovi mikroorganizmi također sposobni razgraditi laktone homoserina.

bakterija tla Variovorax paradoxus mogu koristiti acilhomoserinske laktone kao jedini izvor ugljika i dušika. Ova činjenica ukazuje da u njihovim prirodnim staništima V.paradoxus mogu rasti na laktonima acilhomoserina, što ima koristi od kompetitivne egzacerbacije u okruženju. U ovom slučaju, enzim koji uništava acil homoserin laktone razlikuje se od AiiA-laktonaze: to je aminoacilaza koja cijepa laktonski prsten od acil grupe.

Zbog činjenice da kvorum sensing sistemi kontrolišu virulentnost kod mnogih životinjskih i biljnih patogena, ovi sistemi se mogu smatrati potencijalnim metama za delovanje antimikrobnih agenasa. Prvo, jedna strategija je inhibiranje sinteze molekula prekursora acilhomoserin laktona ili samih acilhomoserin laktona. Drugo, sistemi koji kontroliraju oslobađanje i difuziju acil homoserin laktona mogu poslužiti kao mete za lijekove. Treće, antagonisti slični acilhomoserin laktonima mogu se takmičiti sa laktonima acilhomoserina u vezivanju za LuxR homologe. Četvrto, moguće je koristiti enzime koji cijepaju acil homoserin laktone, kao i antitijela na ove molekule. I, konačno, kao što je nedavno pokazano, aiiA geni koji kodiraju laktonaze ​​koji razgrađuju laktone acilhomoserina mogu se uvesti u genom biljke, ekspresirajući u kojem bi mogli pružiti zaštitu biljci domaćinu od patogenih mikroorganizama. Tako su transgene biljke duhana s uključenim aiiA genom uspješno odolijevale infekciji E. carotovora.

Bakterijski citokini

Utvrđeno je da prokariotski mikroorganizmi sintetiziraju tvari slične hormonima kralježnjaka (uključujući steroide i polipeptidne hormone kao što je inzulin). Sve veći broj dokaza naglašava važnost kemijski posredovanih međućelijskih interakcija u bakterijskim kulturama za događaje kao što su sporulacija, konjugacija, virulencija i bioluminiscencija. Stoga su danas mnoge studije iz oblasti mikrobiologije posvećene interakcijama između mikroorganizama koje se zasnivaju na upotrebi bakterijskih citokina.

Poznato je da se mikroorganizmi mogu fleksibilno prilagoditi promjenjivim uvjetima okoline (posebno nedostatku nutrijenata). U isto vrijeme, neki od njih imaju genetski fiksiranu specifičnu organizaciju metabolizma, što im omogućava postojanje pri vrlo niske koncentracije nutrijenti (oligotrofi). Ćelije druge kategorije (kopiotrofi), kada je okolina iscrpljena, mogu uključiti posebne programe za doživljavanje nepovoljnih uslova. Neki od njih formiraju specijalizirane strukture (spore i ciste) koje su izuzetno otporne na različite stresove, dok su nesporulirajuće bakterije sposobne preživjeti nepovoljne uslove, ostajući vegetativne ćelije sa smanjenom metaboličkom aktivnošću, tj. prelazeći u posebno VBNC (viable but nonculturalable - održivo, ali ne kultivisano) stanje. Prirodno, nekultivisane bakterije ostaju izvan okvira općeprihvaćenih metoda istraživanja (zasijavanje na čvrste ili tekuće podloge ne dopušta njihovo otkrivanje). Na primjer, patogeni opasne bolesti, poput kolere i kampilobakterioze, imaju tendenciju stvaranja nekultiviranih oblika. Mikroskopskim ispitivanjem uzoraka izolovanih iz okoline (zemlja, riječnih i morskih voda, itd.) otkrivene su mnoge ćelije koje zbog metaboličke aktivnosti ne mogu formirati potpunu kulturu (tj. nekultivisane). Trenutno je poznato samo nekoliko primjera transformacije takvih bakterija u normalne kultivirane stanice. Koncept rasta mikroorganizama ovisnog o citokinu omogućava nam da preispitamo problem odabira medija za restauraciju nekulturnih oblika.

Nekultivirani oblici patogenih bakterija nalaze se ne samo u okolišu, već iu tkivima, organima ljudi i životinja. Najčešće se razlikuju morfološki i biohemijski. Na primjer, uzročnik tuberkuloze u tkivima formira atipične kokoidne oblike. Moguće je da su takve ćelije posebne preživjele forme sposobne za aktivaciju i reprodukciju. Postojanje takvih uspavanih oblika može objasniti rekurentne relapse bolesti kod naizgled izliječenih pacijenata. Pokazalo se da ćelije Mycobacterium tuberculosis može se transformirati u kokoidno stanje koje se ne replicira pod mikroaerofilnim uvjetima in vitro koje se često dešavaju in vivo(na primjer, kod granuloma). Kokoidni oblici su takođe pronađeni za Campylobacter jejuni I Helicobacter pylori. Pretpostavlja se da se formiraju u tkivima kao odgovor na djelovanje lijekova i, moguće, da su u mirovanju stanice otporne na antibiotike. Međutim, podaci o uzgoju takvih oblika vrlo su kontradiktorni. Moguće je da takve bakterije mogu aktivirati neki specifični faktori rasta, čiju ulogu vjerovatno imaju citokini domaćina. Na primjer, rast bacila tuberkuloze unutar monocita bio je značajno stimuliran transformirajućim faktorom rasta (TGF-1), dok je rast stanica M.tuberkuloza I M.avium Unutar makrofaga značajno je ubrzan u prisustvu epidermalnog faktora rasta. Očigledno, faktori citokina domaćina mogu igrati važnu ulogu i u aktivaciji uspavanih bakterija i u reprodukciji aktivnih patogena. Smanjenje razine inzulina u krvi pacijenata s dijabetesom dovodi do značajnog proliferacije stanica. Pseudomonas pseudomallei, koji su uzročnici melioidoze, a transferin ima veliki značaj za rast i preživljavanje unutar ćelija makrofaga miša Francisella tularensis.

Moguće je da specifični bakterijski citokini također igraju značajnu ulogu u formiranju oblika u mirovanju i njihovom oporavku u aktivne stanice koje se dijele. Zatim, uzimajući u obzir probleme nastanka rezistencije na antibiotike, teško je precijeniti važnost pronalaženja autokrinih faktora rasta neophodnih za rast patogenih bakterija, a samim tim i meta za djelovanje fundamentalno novih antibiotika koji su netoksični za pacijenta.

Upotreba specifičnih bakterijskih citokina također može značajno poboljšati situaciju s uzgojem nekulturnih bakterija u podlogama koje nisu sasvim pogodne za njihovu reprodukciju. Na primjer, mikrokoki koji obično ne rastu na minimalnom sukcinatnom mediju počinju se normalno razmnožavati u njemu u prisustvu autokrinog faktora Rpf (faktor koji promoviše oživljavanje), dok isprane stanice Mycobacterium smegmatis, koji rastu na minimalnom mediju samo kada se doda Rpf ekstrahovan iz Micrococcus luteus, može se smatrati modelom populacije "izgladnjelih" bakterija u tlu, koja vjerovatno zahtijeva prisustvo specifičnog citokina za početak diobe. Upotreba specifičnih bakterijskih citokina također može značajno poboljšati situaciju s uzgojem nekulturnih bakterija u podlogama koje nisu sasvim pogodne za njihovu reprodukciju. Geni koji su slični genu koji kodira Rpf protein u M.luteus, su široko rasprostranjene među gram-pozitivnim bakterijama sa visokim sadržajem G+C, koje uključuju Streptomycetes, Corynebacteria i Mycobacteria. Ova činjenica otvara nove mogućnosti u prevenciji i liječenju bolesti uzrokovanih mikrobnim agensima, a također nam omogućava da drugačije sagledamo složeni kompleks međuvrsnih interakcija bakterija u prirodnim staništima mikroorganizama.

Posljednje ažuriranje: 20.02.2004

LITERATURA

1. Oleskin A.V., Botvinko I.V., Tsavkelova E.A. Kolonijalna organizacija i međućelijska komunikacija u mikroorganizmima. Microbiology 2000; 69:3:309-327.
2. Fuqua W.C., Winans S., Greenberg E. Quorum sensing in bakterije: Lux R-Lux I porodica regulatora transkripcije koji reaguju na gustinu ćelija. J Bacteriol 1994; 176:2:269-275.
3. Meighen E. Molekularna biologija bakterijske bioluminiscencije. Microbiol Rev 1991; 55:1:123-142.
4. Winans S.C., Bassler B.L. Mafijaška psihologija. J Bacteriol 2002; 184:4:873-883.
5. Writh R., Muscholl A., Wanner G. Uloga feromona u bakterijskim interakcijama. Trends Microbiol 1996; 4:3:96-103.
6. Khokhlov A.S. Mikrobni autoregulatori male molekularne težine. M.: 1988; 270.
7. Waldburger C., Gonzalez D., Chambliss G.H. Karakterizacija novog faktora sporulacije u Bacillus subtilis. J Bacteriol 1993; 175: 6321-6327.
8. Pestova E., Havarstein L., Morrison D. Regulacija kompetencije za genetsku transformaciju u Streptococcus pneumoniae autoindukovanim peptidnim feromonima i dvokomponentnim regulatornim sistemima. Mol Microbiol 1996; 21:4: 853-862.
9. Alloing G., Martin B., Granadel G., Claveris J. Razvoj kompetencije u Streptococcus pneumoniae: autoindukcija feromona i kontrola quorum-sensinga pomoću oligopeptidne permeaze. Ibid 1998; 9:1:75-83.
10. Prozorov A.A. Kompetentnost feromona u bakterijama. Microbiology 2001; 70:1:5-14.
11. Salmond G., Bycroft B., Stewart C., Williams P. Bakterijska "enigma": razbijanje koda komunikacije stanica-ćelija. Mol Microbiol 1995; 16:4:615-624.
12. Greenberg E., Winans S., Fuqua C. Quorum-sensing by bakterija. Ann Rev Microbiol 1996; 50:727-751.
13. Otto M., Sussmuth R., Vuong C. et al. Inhibicija ekspresije faktora virulencije u Staphylococcus aureus by the Staphylococcus epidermidis agrferomona i derivata. FEBS Lett. 1999; 450:257-262.
14. Dong Y., Xu J., Li X., Zhang L. AiiA, enzim koji inaktivira signal kvoruma za acil-homoserin lakton i smanjuje virulenciju Erwinia carotovoru. Proc Natl Acad Sci 2000; 97:7: 3526-3531.
15. Byers J., Lucas C., Salmond G., Welch M. Neenzimski obrt Erwinia carotovora signalni molekul koji osjeća kvorum. J Bacteriol 2002; 184:4: 1163-1171.
16. Calfee M., Coleman J., Pesci E. Interferencija sa sintezom signala kinolona Pseudomonas inhibira ekspresiju faktora virulencije putem Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci 2001; 98:20:11633-11637.
17. Nakayama J., Takanami Y., Horii T. et al. Molekularni mehanizam signalizacije feromona specifičnih za peptide Enterococcus faecalis: funkcije feromonskog receptora TraA i proteina TraC koji se vezuje za feromone kodiranog plazmidom pPDI. J Bacteriol 1998:180:3:449-456.
18. Mylonakis E., Engelbert M., Qin X. et al. The Enterococcus faecalis gen fsrB, ključna komponenta fsr kvorum-sensing sistema, povezan je sa virulencijom u modelu endoftalmitisa zeca. Infect Immun 2002; 70:8:4678-4681.
19. Sifri C., Mylonakis E., Singh V. et al. Efekat virulencije od Enterococcus faecalis geni proteaze i skakavci koji čuju kvorum u Caenorhabditis elegans i miševima. ibid 2002; 70:10: 5647-5650.
20. Matson M., Armitage J., Hoch J., Macnab R. Bakterijska lokomocija i transdukcija signala. J Bacteriol 1998; 180:5:1009-1022.
21. Onaka H., Horinouchi S. DNK-vezujuća aktivnost proteina receptora A faktora i njegove DNK sekvence prepoznavanja. Mol Microbiol 1997; 24:991-1000.
22. Onaka H., Ando N., Nihira T., Yamada Y. et al. Kloniranje i karakterizacija gena receptora A-faktora iz Streptomyces griseus. J Bacteriol 1995; 177:21:6083-6092.
23. Ohnishi Y., Kameyama S., Onaka H., Horinouchi S. Regulatorna kaskada A-faktora koja vodi do biosinteze streptomicina u Streptomyces griseus: identifikacija ciljnog gena receptora A-faktora. Mol Microbiol 1999; 34:102-111.
24. Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. Sigma faktor ovisan o A-faktoru ekstracitoplazmatske funkcije (OAdsA) koji je neophodan za morfološki razvoj u Streptomyces griseus. J Bacteriol 2000; 182:16:4596-4605.
25. Kato J., Suzuki A., Yamazaki H. et al. Kontrola pomoću A-faktora gena metaloendopeptidaze koji je uključen u formiranje zračnog micelija u Streptomyces griseus. ibid 2002; 184:21:6016-6025.
26. Onaka H., Nikagawa T., Horinouchi S. Učešće dva homologa receptora A-faktora u Streptomyces coelicolor A3(2) u regulaciji sekundarnog metabolizma i morfogeneze. Mol. mikrobiol. 1998; 28:4:743-753.
27. Revenchon S., Bouillant M., Salmond G., Nasser W. Integracija kvorum-sensing sistema u regulatorne mreže koje kontroliraju sintezu faktora virulencije u Erwinia chrysanthemii. Mol Microbiol 1998; 29:1407-1418.
28. Chatterjee A., Cui Y., Chatterjee A.K. RsmA i kvorum senzorski signal, N--L-homoserin lakton, kontrolišu nivoe rsmB RNK u Erwinia carotovora subsp. carotovora utičući na njegovu stabilnost. J Bacteriol 2002; 184:15: 4089-4095.
29. Kohler T., Van Delden C., Curty L. et al. Prekomjerna ekspresija MexEF-OprN sistema efluksa više lijekova utiče na signalizaciju od stanice do stanice u Pseudomonas aeruginosa. Ibid 2001; 183:18:5213-5222.
30. Gallagher L., McKnight S., Kuznetsova M. el. Funkcije potrebne za ekstracelularnu signalizaciju kinolona Pseudomonas aeruginosa. ibid 2002; 184:23:6472-6480.
31. Parsek M., Greenberg P. Acil-homoserin lactone quorum sensing u gram-negativnim bakterijama: signalni mehanizam uključen u asocijacije s višim organizmima. Proc Natl Acad Sci 2000; 97:16:8789-8793.
32. Conway V.A., Wepi V., Speert D. Formiranje biofilma i proizvodnja acil-homoserin laktona u Burkholderia cepacia kompleks. J Bacteriol 2002; 184:20:5678-5685.
33. Kolenbrander P., Andersen R., Blehert D. et al. Komunikacija među oralnim bakterijama. Microb. Molecular Biology Rev 2002; 66:3:486-505.
34. Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bakterije. Annu Rev Microbiol 2001; 55:165-199.
35. Frias J., Olle E., Alsina M. Parodontalni patogeni proizvode signalne molekule koji otkrivaju kvorum. Infect Immun 2001; 69:3431-3434.
36. McNab R., Ford S., EI-Sabaeny A. et al. Signalizacija zasnovana na LuxS-u Streptococcus gordonii: Autoinduktor 2 kontrolira metabolizam ugljikohidrata i stvaranje biofilma Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 2003; 185:1:274-284.
37. Bassler B., Wright M., Silverman M. Višestruki signalni sistemi koji kontrolišu ekspresiju luminescencije u Vibrio harveyi: sekvenca i funkcija gena koji kodiraju drugi senzorni put. Mol Microbiol 1994; 13:273-286.
38. Ji G., Beavis R., Novick R. Bakterijske interferencije uzrokovane autoinducirajućim varijantama peptida. Science 1997; 276:2027-2030.
39. Lee S., Park S., Lee J., et al. Geni koji kodiraju enzim N-acyi homoserin koji razgrađuje lakton široko su rasprostranjeni u mnogim podvrstama Bacillus thuringiensis. Apple Environ Microbiol 2002; 68:8:3919-3924.
40. Leadbetter J., Greenberg E. Metabolizam signala quorum-sensing acilhomoserine lactone by Variovorax paradoxus. J Bacteriol 2000; 182:6921-6926.
41. Hoang T., Schweizer H. Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoil-acil nosač protein reduktaza (Fabl): meta za antimikrobni triklosan i njegovu ulogu u sintezi aciliranog homoserin laktona. Ibid 1999; 181:. 5489-5497.
42. Pearson J., Delden C., Iglewski B. Aktivni efluks i difuzija su uključeni u transport Pseudomonas aeruginosa signali od ćelije do ćelije. J. Bacteriol. 1999; 181: 1203-1210.
43. Manefield M., Welch M., Givskov G. et al. Halogene furanoze iz crvene alge, Delisea pulchra, inhibiraju sintezu antibiotika karbapenema i proizvodnju faktora virulencije egzoenzima u fitopatozi Erwinia carotovora. FEMS Microbiol Lett 2001; 205:131-138.
44. Dong Y., Wang L., Xu J. et al. Gašenje bakterijske infekcije zavisne od kvoruma pomoću N-acil homoserin laktonaze. Priroda. 2001; 411:813-817.
45. Romanova Yu.M., Gintsburg A.L. Citokini su mogući aktivatori rasta patogenih bakterija. Vesti RAMN 2000; 1:13-17.
46. Barcina I., Lebaron P., Vives-Rego J. Opstanak alohtonih bakterija u vodenim sistemima: biološki pristup. FEMS Microbiol Ecol 1997; 23:1-9.
47. Heim S., Lleo M., Bonato B. et al. Održivo, ali nekulturno stanje i gladovanje su različite reakcije na stres Enterococcus faecalis, kako je utvrđeno proteomskom analizom. J Bacteriol 2002; 184:23: 6739-6745.
48. Xu H., Roberts N., Singleton F. el. Opstanak i održivost nekulturnih Escherichia coli i Vibrio cholerae u estuarinskom i morskom okruženju. Microb Ecol 1982; 8:313-323.
49. Kell D., Kaprelyants A., Grafen A. Feromoni, socijalno ponašanje i funkcije sekundarnog metabolizma u bakterijama. Trends In Ecology & Evolution 1995; 10:126-129.
50. Domingue G., Woody H. Bakterijska perzistencija i ekspresija bolesti. Clin Microbiol Rev 1997; 10:320-328.
51. Khomenko A. Varijabilitet Mycobacterium tuberculosis kod pacijenata sa kavitarnom plućnom tuberkulozom u toku kemoterapije. Tubercle Lung Disease 1987; 68:243-253.
52. Gangadharam P. Mycobacterial dormancy. Tub Lung Dis 1995; 76:477-479.
53. Wayne L. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis i latencija bolesti. European J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13:908-914.
54. Wayne L., Hayes L. An in vitro model za sekvencijalno proučavanje pomaka prema dolje Mycobacterium tuberculosis kroz 2 faze nereplicirajuće postojanosti. Infect Immun 1996; 64:2062-2069.
55. Beumer R., Devries J., Rombouts F. Campylobacter jejuni nekulturne kokoidne ćelije. Intern J Food Microbiol 1992; 15:153-163.
56. Kusters J., Gerrits M., Van Strijp J. el at. kokoidnih oblika Helicobacter pylori su morfološke manifestacije ćelijske smrti. Infect Immun 1997; 65:3672-3679.
57. Cellini L., Hui P., Leung K. el at. Coccoid Helicobacter pylori nije kultivisan in vitro vraća se kod miševa. Microbiol Immun 1994; 38:843-850.
58. Hirsch C., Yoneda T., Averill L. et al. Poboljšanje intracelularnog rasta Mycobacterium tuberculosis u ljudskim monocitima transformacijom faktora rasta-b-l. J. Infect Dis 1994; 170:1229-1237.
59. Bermudez. L., Pelrofsky M. Regulacija izraza Mycobacterium avium kompleksni proteini se razlikuju u zavisnosti od okruženja unutar ćelija domaćina. Immunol Cell Biol 1997; 75:35-40.
60. Woods D., Jones A., Hill P. Interakcija insulina sa Pseudomonas pseudomallei. Infect Immun 1993; 61:4045-4050.
61. Fortier A., ​​Leiby D., Narayanan R. et al. Rast od Francisella tularensis LVS u makrofagima - kiseli intracelularni odjeljak obezbjeđuje esencijalno željezo potrebno za rast. Ibid 1995; 65:1478-1483.
62. Duncan S., Glover L., Killham K., Prosser J. Detekcija aktivnosti izgladnjelih i održivih, ali nekulturnih bakterija zasnovana na luminiscenciji. Apple Environ Microbiol 1994; 60:1308-1316.
63. Young D., Duncan K. Izgledi za nove intervencije u liječenju i prevenciji mikobakterijskih bolesti. Ann. Rev. mikrobiol. 1995; 49:641-673.
64. Mukamolova G., Kapreilyants A., Young D. et al. Bakterijski citokin. Proc Nat! Acad.Sci USA. 1998; 95: 8916-8921.
65. Shleeva M.O., Mukamolova G.V., Telkov M.V. et al Formiranje “nekultivisanih” ćelija Mycobacterium tuberculosis i njihovo oživljavanje. Microbiology 2003; 72:76-83.

Vlasnici patenta RU 2534617:

Pronalazak se odnosi na područje mikrobiologije, biotehnologije i farmacije, odnosno na male regulatorne molekule sposobne da usmjerno mijenjaju komunikaciju ovisnu o gustoći i kolektivno ponašanje koje reguliše („čulo kvoruma“) kod bakterija. Konkretno, pronalazak se odnosi na upotrebu derivata tiazola formule 1 kao regulatora (aktivatora ili inhibitora) kolektivnog ponašanja ("osjećanje kvoruma") kod bakterija. DEJSTVO: Derivat tiazola namenjen za regulaciju "čula kvoruma" posredovanog homoserin laktonima u biotehnološki korisnim, truležnim i patogenim bakterijama koje proizvode violacein. 2 ill., 1 tab., 2 pr.

Pronalazak se odnosi na mikrobiologiju, biotehnologiju i farmaceutiku i odnosi se na male regulatorne molekule sposobne da usmjeravaju (oslabe ili jačaju) komunikaciju zavisnu od gustoće i kolektivno ponašanje koje regulira ("čuj kvoruma") u bakterijama. Pronalazak može naći primenu u kontroli biotehnoloških procesa, proizvodnji sredstava za sprečavanje kvarenja poljoprivrednih proizvoda, kao i stvaranju novih lekova namenjenih kontroli i upravljanju bakterijskim infekcijama biljaka, životinja i ljudi.

Otkriće komunikacije zavisne od gustoće u bakterijama s karakterizacijom temeljnih molekularno genetskih mehanizama bilo je jedno od najupečatljivijih otkrića u mikrobiologiji na kraju 20. stoljeća. Istovremeno, ovaj fenomen kolektivnog ponašanja bakterija, označen konceptom "quorum sensing" (engleski - quorum sensing), omogućio je da se na fundamentalno nov način procijene niz primjera funkcionalne i morfološke diferencijacije prokariota, uključujući razvoj bioluminiscencije, sintezu pigmenata i antibiotika, stvaranje egzoenzima i faktora virulencije, formiranje biofilma, konjugaciju i sporulaciju.

Prva od opisanih i najčešća varijanta “quorum sensinga” među mikroorganizmima su sistemi slični luxI/luxR, u kojima se molekula autoinduktora signala sintetizirana pod kontrolom luxI gena difundira u vanjsko okruženje, a kada kritična populacija gustoću i vlastitu graničnu koncentraciju koja je određena ovim obrnutim kretanjem unutar bakterijske ćelije, gdje, vezivanjem za LuxR regulatorni protein, pokreće transkripciju ciljnih gena. Istovremeno, analiza hemijske prirode takvih autoinduktora omogućila je da se okarakterišu kao različite varijante aciliranih homoserin laktona (HSL).

Dešifrovanjem molekularno-genetskih mehanizama kolektivnog ponašanja, kao i utvrđivanjem važne biološke uloge komunikacionih sistema zavisnih od gustine, utvrđena je relevantnost traženja pristupa upravljanju osećajem kvoruma. Predložena rješenja su: 1) supresija sinteze autoinduktora; 2) njegovu razgradnju specifičnim enzimima (laktonaza ili acilaze); 3) upotreba GSL agonista i antagonista sposobnih da direktno interferiraju sa prirodnim signalom za vezivanje za proteine ​​slične luxR-u. Upravo potonji pristup, koji se najintenzivnije razvija u mnogim laboratorijama širom svijeta i koji je doveo do stvaranja nekoliko stotina aktivnih spojeva do danas, čini teorijsku osnovu za ovaj izum.

Analiza otvorenih izvora patenata nam omogućava da konstatujemo da je najbliži analog izuma za koji se traži patent patent, čija formula i opis sadrže informacije o nizu jedinjenja, u zavisnosti od predmeta uticaja, sposobnih da izazovu bilo koju aktivaciju (agonističko ) ili inhibitorni (antagonistički) efekti u odnosu na posredovano homoserin laktonima "quorum sensing" kod određenih vrsta bakterija. Istovremeno, aplikanti su takve supstance bazirali na laktonskom prstenu sličnom prirodnom HSL-u, da bi mu dali dodatne modulirajuće aktivnosti, izvršena je kovalentna modifikacija sa acil grupama različitih struktura i sastava. Međutim, značajna strukturna sličnost predložene grupe molekula sa prirodnim signalima ne samo da pruža mogućnost interferencije između njih na koju su naveli podnosioci prijava, već potencijalno zadržava mogućnost razvoja nerazračunatih efekata u odnosu na druge mikroorganizme, komunikacije zavisne od gustine između koji je posredovan strukturno sličnim GSL-ovima.

S druge strane, u pogledu hemijske strukture jedinjenja za koje se traži zahtev, najbliže poznato tehničko rešenje je patent, čija formula i opis sadrže informacije o nizu jedinjenja zasnovanih na petočlanom tiazolnom prstenu kovalentno vezan za supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil, aril i druge grupe. Međutim, ovaj patent ne ukazuje na mogućnost upotrebe ovih jedinjenja za regulaciju kolektivnog ponašanja (“quorum sensing”) kod bakterija, a glavna svrha navedenih jedinjenja je njihova upotreba kao antagonista adenozinskih receptora.

Dakle, pronalazak za koji se traži zaštita nije poznat iz stanja tehnike, što određuje njegovu usklađenost sa zahtjevom novine.

Cilj ovog izuma je razviti spoj strukturno različit od homoserinskih laktina, koji ima selektivnu i izraženu sposobnost regulacije (i povećanja i smanjenja) GSL-posredovanog kolektivnog ponašanja (“quorum sensing”) u određenom rasponu biotehnološki korisnih, truležne i patogene bakterije.

U ovom izumu, ovaj problem je riješen korištenjem spoja na bazi tiazola, koji je u potpunosti opisan formulom 1:

Ovaj pronalazak otkriva strukturnu formulu spoja formule 1 i metode njegove praktične primjene za regulaciju kolektivnog ponašanja ("quorum sensing") kod bakterija.

U skladu sa ovim izumom, regulatorni preparat (kompozicija) na bazi derivata tiazola sadrži težinski od 0,0001 do 100% jedinjenja formule 1, ostatak su neutralne komponente ili supstance koje pozitivno modifikuju (povećavaju bioraspoloživost, produžavaju trajanje djelovanja, itd.) svojstava ovih kompozicija.

U poređenju sa jedinjenjima koja čine suštinu poznatih patenata, jedinjenje formule 1 ima niz značajnih razlika, a to su:

Prvo, za razliku od poznatih spojeva baziranih na laktonskom prstenu i, s tim u vezi, bliski strukturni analozi prirodnih autoregulatornih molekula - homoserin laktona, predmetno jedinjenje je sintetički ligand koji se strukturno razlikuje od njih. Regulatori "quorum sensing" na bazi tiazola nisu poznati iz dostupne naučne i patentne literature;

drugo, za razliku od poznatih derivata tiazola opšte formule 2

jedinjenje za koje se tvrdi da ima samo jednu varijantu kovalentno vezanog radikala, koji odgovara R4 na svom položaju i potpuno je opisan ostatkom heksanske kiseline analognim prirodnom signalnom molekulu (heksanoil-homoserin lakton), u odsustvu drugih promjena u radikalima R 1, R 2 i R 3 \u003d H. Pored toga, za razliku od poznatog patenta, koji predviđa upotrebu jedinjenja opšte formule 2 kao antagonista adenozinskih receptora, jedinjenje formule 1 za koje se traži zahtev ima za cilj da reguliše kolektivno ponašanje posredovano GSL-om (“quorum sensing”) kod bakterija;

treće, zbog strukturnih razlika u odnosu na prirodne autoregulatorne molekule koji su aktivni u mnogim luxI/luxR sistemima, jedinjenje formule 1 ima selektivnu (selektivnu) regulatornu aktivnost implementiranu u odnosu na cviI/cviR-regulisani sistem biosinteze violaceina Chromobacterium violaceum, kao i druge biotehnološki korisne, truležne i patogene bakterije koje proizvode violacein (vidi primjer 1). Istovremeno, vjerojatni razlog selektivnog djelovanja jedinjenja formule 1 u imenovanim sistemima "quorum sensing" leži u selektivnoj interakciji sa CviR regulatornim proteinom i njegovim bliskim homolozima, ali ne i sa drugim proteinima sličnim LuxR-u. Zauzvrat, prirodna raznolikost proteina sličnih CviR-u određuje mogućnost njihove pozitivne i negativne regulacije traženim spojem, koji će se u različitom rasponu biotehnološki korisnih, truležnih i patogenih bakterija koje proizvode violacein manifestirati ili kao povećanje ( vidi primjer 1) ili kao slabljenje (vidi primjer 2) kolektivno ponašanje.

Da bi se razumela suština pronalaska, potrebno je takođe istaći da regulacija „osetljivosti kvoruma“ koja se postiže upotrebom jedinjenja formule 1 uključuje, ali nije ograničena na, efekat na proizvodnju violaceina, jer. Pod kontrolom regulatornog proteina CviR i njegovih homologa, postoji niz ciljnih gena (operona), uključujući one odgovorne za proizvodnju egzoenzima i formiranje biofilma. Upotreba testa za indukciju ili inhibiciju biosinteze violaceina u ovom pronalasku određena je jednostavnošću i informativnošću registrovane manifestacije regulatorne aktivnosti jedinjenja formule 1.

Dakle, rezultat djelovanja jedinjenja formule 1 je specifična regulacija određenog sistema "osjećanja kvoruma", čiji je smjer (jačanje ili slabljenje) određen karakteristikama receptora proteina sličnih CviR-u koji percipiraju to. Dakle, upotrebom istog spoja moguće je utjecati na kolektivno ponašanje različitih mikroorganizama u različitim smjerovima, uključujući izolovano ili u njihovoj miješanoj kulturi.

Zaštićena upotreba jedinjenja formule 1 podrazumeva, između ostalog, njegovu upotrebu za kontrolu biotehnoloških procesa koji se provode uz pomoć mikroorganizama koji proizvode violacein (za referencu: violacein je derivat indola koji nastaje oksidacijom triptofana, plavo-ljubičastog pigment s antibakterijskim, protistocidnim, antivirusnim i drugim biotehnološki i farmakološki korisnim djelovanjem). U ovom slučaju, spoj formule 1 može se uvesti u čvrste ili tekuće hranjive podloge u obliku otopina, kao i koristiti kao čista supstanca ili imobilizirati na različitim nosačima.

Patentirani pronalazak uključuje i upotrebu spoja formule 1 za regulaciju aktivnosti drugih ciljnih gena (operona), uključujući one koji su uključeni u kvarenje poljoprivrednih proizvoda, kao i razvoj zaraznih bolesti biljaka, životinja i ljudi. U tu svrhu, ovo jedinjenje se može davati u organizam kako bi se obezbedio sistemski efekat, kao i lokalno da se utiče na određena područja (na primer, kao deo zavoja za ranu, prilikom tretiranja hirurškog polja, itd.). Jedinjenje se može koristiti kao čvrste tvari, otopine ili suspenzije u vodi ili drugim rastvaračima i primijeniti na različite nosače. Također je moguće koristiti jedinjenje formule 1 u kompozicijama s drugim supstancama, uključujući pozitivno modificiranje (povećanje bioraspoloživosti, trajanje djelovanja) njegove biološke aktivnosti.

Pronalazak za koji se traži zaštita je ilustrovan, ali nije ni na koji način ograničen, sljedećim primjerima.

Primjer 1. Stimulacija kolektivnog ponašanja ("quorum sensing") kod bakterija.

Određivanje sposobnosti jedinjenja formule 1 da regulišu „osjećaj kvoruma“ obavljeno je pomoću dva bakterijska test sistema, u prisustvu heksanoil-homoserin laktona (C 6 -GSL)? odgovoran za sintezu pigmenta violaceina (Chromobacterium violaceum NCTC 13274) ili razvoj bioluminiscencije (Escherichia coli pAL103). Istovremeno, prva karakteristika je bila umetanje Tn5 transpozona u cvil gen, odgovoran za sintezu vlastitog C 6 -HSL, uz održavanje funkcionalno aktivnog cviR gena i regulatornog proteina koji je kodiran njime, a koji je odgovoran za percepciju autoinduktora.

Quomm sensing i Chrornobacteriurn violaceum: iskorištavanje proizvodnje i inhibicije violaceina za detekciju N-acil homoserin laktona. Microbiology, 1997, V.143, P.3703-3711]. Zauzvrat, karakteristika drugog soja je prisustvo genetskog konstrukta luxR + luxI_luxCDABE, koji kodira LuxR Vibrio fischeri receptor protein i, u prisustvu egzogeno uvedenog C6-GSL ili C6-oxo-GSL, reaguje na razvoj luminiscencije (bioluminescencije).

Prilikom testiranja, C. violaceum NCTC13274 i Escherichia coli pAL103 uzgajane su na tekućim hranjivim podlogama u odsustvu (kontrola) iu prisustvu C6-GSL ili spoja formule 1 (eksperiment) korištenog u rasponu koncentracija od 2 do 1000 μm. Karakteristika regulatornog djelovanja bila je vrijednost EC50 – koncentracija upoređivanih jedinjenja, koja uzrokuje indukciju stvaranja violaceinskog pigmenta ili bioluminiscencije za 50% najizraženijeg efekta u prisustvu prirodnog signala. Rezultati takvog testiranja ilustrirani su na slici 1, a sažeti su u tabeli 1.

Tabela 1. Procjena efekta jedinjenja formule 1 na kolektivno ponašanje ("quorum sensing") kod bakterija u testovima za C. violaceum NCTC13274 i E. coli pAL103.

Iz prikazanih podataka može se vidjeti da oba korišćena mikroorganizma intenzivno reaguju sa kvorum-zavisnom sintezom violaceina (C. violaceum NCTC) ili razvojem bioluminiscencije (E. coli pAL103) u prisustvu prirodnog autoregulatora C 6 -GSL. Zauzvrat, test spoj formule 1 djeluje manje aktivno, ali preciznije, izaziva indukciju sinteze violaceina, ali ne i razvoj bioluminiscencije. U isto vrijeme, ove razlike su vjerovatno zasnovane na selektivnom afinitetu spoja 1 za CviR protein koji prima regulatorni signal, u odsustvu takvog afiniteta za LuxR.

Pozitivan rezultat takve upotrebe predmetnog izuma je mogućnost selektivne indukcije "osjećanja kvoruma" određenih vrsta bakterija koje su dio polimikrobnih asocijacija.

Primjer 2. Potiskivanje kolektivnog ponašanja (“quorum sensing”) kod bakterija.

Određivanje sposobnosti jedinjenja formule 1 da regulišu „osećaj kvoruma“ sprovedeno je korišćenjem soja Jantinobacterium lividum deponovanog u Sveruskoj zbirci industrijskih mikroorganizama (VKPM) pod br. B-10136. Ovaj soj je prirodni izolat karakteriziran sposobnošću sintetiziranja pigmenta violaceina pod kontrolom autoinduktora neidentifikovane prirode.

Prilikom testiranja, J. lividum B-10136 je uzgajan na tečnim hranljivim podlogama u odsustvu (kontrola) iu prisustvu jedinjenja formule 1 (eksperiment), korišćenog u opsegu koncentracija od 2 do 1000 μm. Karakteristika regulatornog djelovanja bila je vrijednost EC50 - koncentracija jedinjenja formule 1, koja uzrokuje supresiju proizvodnje violaceina za 50% od najizraženijeg efekta u kontroli.

Rezultati takvog testiranja ilustrovani su na Sl.2. Iz gornjih podataka proizilazi da test jedinjenje formule 1 inhibira proizvodnju violaceina (EC50=87,5 μm), što ga karakteriše kao inhibitora kolektivnog ponašanja („quorum sensing“) J. lividum B-10136.

Pozitivan rezultat takve upotrebe predmetnog izuma je sposobnost suzbijanja "čula kvoruma" određenih vrsta bakterija, posebno J. lividum, kako bi se spriječila šteta koju oni uzrokuju poljoprivrednim proizvodima. Ista aktivnost se može koristiti u liječenju i prevenciji zaraznih bolesti biljaka, životinja i ljudi uzrokovanih J. lividum i drugim mikroorganizmima koji proizvode violacein.

Upotreba derivata tiazola formule 1 kao regulatora (aktivatora ili inhibitora) kolektivnog ponašanja („osjećanje kvoruma“) kod bakterija:

Slični patenti:

Pronalazak se odnosi na oblast organske hemije, odnosno na nove biološki aktivne supstance klase 4-aril-2-hidroksi-4-okso-2-butenoata heterolamonijuma, odnosno na 2-hidroksi-4-metilfenil-4- okso-2-butenoat tiazolinil amonijum formule (1).

Pronalazak se odnosi na oblast organske hemije, na nove biološki aktivne supstance klase 4-aril-2-hidroksi-4-okso-2-butenoata heterolamonijuma, odnosno 2-hidroksi-4-okso-4-(4). -hlorofenil)-2-tiazolin amonijum butenoat (1) formule koja ima antikoagulantno dejstvo, što sugeriše njegovu upotrebu u medicini kao antikoagulantno sredstvo.

Pronalazak se odnosi na nove derivate 2-(imino-supstituisanih) tiazolidina, metodu njihovog dobijanja, lekove koji sadrže ove supstance, upotrebu ovih derivata 2-(imino-supstituisanih) tiazolidina za lečenje razne bolesti, kao i dobijanje farmaceutskih kompozicija na njihovoj osnovi koje se koriste za lečenje.

Pronalazak se odnosi na metodu za dobijanje novih biološki aktivnih hemijskih jedinjenja, odnosno na metodu za dobijanje novih derivata iminotiazolidina ili njihovih hidrohlorida, koji imaju antidepresivno, antiepileptičko, antiparkinsonsko i analgetičko dejstvo.

Pronalazak se odnosi na jedinjenje predstavljeno formulom (I), gdje predstavlja α-konfiguraciju; je β-konfiguracija; i predstavlja α-konfiguraciju, β-konfiguraciju ili bilo koju njihovu mješavinu, njihovu sol, ili njihovu mješavinu sa dijastereomerom u proizvoljnom omjeru, ili njegovim ciklodekstrin klatratom.

Pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje kristala A-oblika 2-(3-cijano-4-izobutiloksifenil)-4-metil-5-tiazolkarboksilne kiseline. Metoda uključuje: korak rastvaranja 2-(3-cijano-4-izobutiloksifenil)-4-metil-5-tiazolkarboksilne kiseline u 1-propanolu ili 2-propanolu zagrijavanjem, korak hlađenja nastalog rastvora i korak dodavanja heptana ovoj otopini.

Pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja opšte formule (I) koja imaju svojstva inhibitora monoamin oksidaze (MAO) i/ili peroksidacije lipida, i/ili svojstva modulatora natrijumski kanali, kao i lijek na njihovoj osnovi koji ima ista svojstva, tačnije, spojevi i lijek se mogu koristiti za liječenje Parkinsonove bolesti, senilne demencije, Alchajmerove bolesti, Huntingtonove koreje, amiotrofične lateralne skleroze, šizofrenije, depresije, psihoze , bol i epilepsija.

Pronalazak se odnosi na spoj predstavljen formulom (I), u kojoj A1 označava benzen ili heterocikl izabran iz grupe koju čine piridin, pirazin, imidazol, tiazol, pirimidin, tiofen, piridazin, benzoksazin i oksobenzoksazin; A2 je benzen opciono supstituisan sa fluorom ili tiofenom; B1 je vodonik, niži alkil opciono supstituisan sa piperazinilom ili morfolino, halo-supstituisani niži alkil, niži alkoksi supstituisan sa karbamoilom, acilamino, karbamoilom ili nižim alkilkarboniloksi (pod uslovom da kada je A1 tiazol, B1 nije acilamino); B2 je vodik ili funkcionalna grupa koja sadrži najmanje jedan atom dušika odabran iz grupe koju čine acilamino, pirolidinil, morfolino, piperidinil izborno supstituiran sa acilom, piperazinil izborno supstituiran nižim alkilom ili acil, pirazolil, diazabicikloheptil, opciono supstituiran sa di-(niži alkil)amino, opciono supstituisani amino ili acilamino (pod uslovom da kada je A1 tiazol, B2 nije acilamino); Y je grupa predstavljena formulom (II) u kojoj je J etilen ili niži alkinilen; L je veza; M označava vezu; X je -(CH2)m-, -(CH2)m-O- ili -(CH2)m-NR2- (gdje je m cijeli broj od 0 do 3, a R2 je vodonik); D je -NR3- gdje je R3 vodonik; i E je amino, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Pronalazak se odnosi na jedinjenja formule 1.0: gde je Q supstituisani tetrahidropiridinil prsten. R5, R1 se biraju iz grupe koju čine: (1) piridil supstituiran sa supstituentom odabranim iz grupe koju čine: -O-CH3, -O-C2H5, -O-CH(CH3)2 i -O-( CH2 )2-O-CH3, R2 se bira iz grupe koju čine: -OCH3 i -SCH3; i R5 se bira iz grupe koju čine: (a) supstituirani triazolilfenil-, gdje je triazolil supstituiran sa jednom ili dvije alkil grupe odabrane iz grupe koju čine: -C1-C4 alkil, (b) supstituirani triazolilfenil-, gdje je triazolil supstituirani na atomu dušika -C1-C4 alkil, (c) supstituirani triazolilfenil-, gdje je triazolil supstituiran na atomu dušika -C2 alkilen-O-C1-C2 alkil, (d) supstituirani triazolilfenil-, gdje je triazolil supstituiran na atom dušika -C2-C4 alkilen-O-CH3, i (e) supstituirani triazolilfenil-, pri čemu je triazolil supstituiran na atomu dušika sa hidroksi-supstituiranim -C1-C4 alkilom, i gdje je fenil po izboru supstituiran sa 1 do 3 supstituenti nezavisno odabrani iz grupe koju čine halogen; i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati, za koje se tvrdi da su ERK inhibitori.

Pronalazak se odnosi na novo sredstvo, koje je derivat rodanina formule (I), za liječenje tumorskih bolesti različite lokalizacije. DEJSTVO: sredstvo antiproliferativnog i antimetastatskog delovanja za lečenje tumorskih bolesti.

Upotreba (R)-5--2-(-propilimino)-3-orto-toliltiazolidin-4-ona (Jedinjenje 1) ili njegove soli za pripremu medicinskog proizvoda za prevenciju i/ili liječenje bolesti ili poremećaj povezan sa aktivacijom imunog sistema sistemi u kojima je lek skup doza jedinjenja 1, a tokom početne faze lečenja doza izaziva desenzibilizaciju srca i ispod je konačne doze, a tokom početne faze lečenja doza izaziva desenzibilizaciju srca. u navedenoj početnoj fazi liječenja, doza se primjenjuje frekvencijom koja održava desenzibilizaciju srca sve dok se ne dogodi sljedeći nagli pad srčane frekvencije, a zatim se doza titrira do konačne doze spoja 1; odgovarajući način liječenja i set doza.

Pronalazak se odnosi na spoj formule I ili njegove terapeutski prihvatljive soli, gdje je A1 furil, imidazolil, izotiazolil, izoksazolil, pirazolil, pirolil, tiazolil, tiadiazolil, tienil, triazolil, piperidinil, morfolinil, morfolinil, dihidro-4-13, dihidro-4-13, tiadiazol-2-il, benzotien-2-il, benzotiazol-2-il, tetrahidrotien-3-il, triazolopirimidin-2-il ili imidazotiazol-5-il; gdje je A1 nesupstituiran ili supstituiran sa jednim ili dva ili tri ili četiri ili pet supstituenata nezavisno odabranih između R1, OR1, C(O)OR1, NHR1, N(R1)2, C(N)C(O)R1, C( O)NHR1, NHC(O)R1, NR1C(O)R1, (O), NO2, F, Cl, Br i CF3; R1 je R2, R3, R4 ili R5; R2 je fenil; R3 je pirazolil ili izoksazolil; R4 je piperidinil; R5 je C1-C10 alkil ili C2-C10 alkenil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa supstituentima odabranim od R7, SR7, N(R7)2, NHC(O)R7, F i Cl; R7 je R8, R9, R10 ili R11; R8 je fenil; R9 je oksadiazolil; R10 je morfolinil, pirolidinil ili tetrahidropiranil; R11 je C1-C10 alkil; Z1 je fenilen; Z2 je piperidin, nesupstituisan ili supstituisan sa OCH3, ili piperazinom; Z1A i Z2A nedostaju; L1 je C1-C10 alkil ili C2-C10 alkenil, bilo nesupstituisan ili supstituisan sa R37B; R37B je fenil; Z3 je R38 ili R40; R38 je fenil; R40 je cikloheksil ili cikloheksenil; gde je fenilen predstavljen sa Z1 nesupstituisan ili supstituisan sa OR41 grupom; R41 je R42 ili R43; R42 je fenil koji nije kondenziran ili kondenziran sa pirolilom, imidazolilom ili pirazolom; R43 je piridinil koji nije kondenziran ili kondenziran sa pirolil; pri čemu je svaki od gornjih cikličkih fragmenata predstavljen sa R2, R3, R4, R8, R9, R10, R38, R40, R42 i R43 nezavisno nesupstituiran ili supstituiran sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih između R57, OR57, C(O)OR57 , F, Cl CF3 i Br; R57 je R58 ili R61; R58 je fenil; R61 je C1-C10 alkil; i pri čemu je fenil predstavljen sa R58 nesupstituiran ili supstituiran sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih između F i Cl. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ova jedinjenja, i na metodu za lečenje bolesti u kojima se eksprimiraju Bcl-2 anti-apoptotički proteini. 4 n. i 3 z.p. f-ly, 2 stola, 48 pr.

Pronalazak se odnosi na područje mikrobiologije, biotehnologije i farmacije, odnosno na male regulatorne molekule sposobne da usmjerno mijenjaju komunikaciju ovisnu o gustoći i kolektivno ponašanje koje njome regulira u bakterijama. Konkretno, izum se odnosi na upotrebu derivata tiazola formule 1 kao regulatora kolektivnog ponašanja kod bakterija. DEJSTVO: Derivat tiazola namenjen za regulaciju "čula kvoruma" posredovanog homoserin laktonima u biotehnološki korisnim, truležnim i patogenim bakterijama koje proizvode violacein. 2 ill., 1 tab., 2 pr.

Hemijska komunikacija u bakterijama (Kvorum Sensing Regulation)

I.A. Khmel, IMG RAS

Posljednjih godina pažnju brojnih istraživača koji se bave mikroorganizmima u različitim oblastima biologije i medicine privukao je fenomen nazvan Quorum Sensing (QS). Quorum Sensing (QS) je posebna vrsta regulacije ekspresije bakterijskih gena koja ovisi o gustini njihove populacije. QS sistemi uključuju signalne molekule niske molekularne težine zvane autoinduktori, koji lako difundiraju kroz ćelijski zid, i regulatorne proteine ​​na koje se vežu autoinduktori (AI). Kako se populacija bakterija povećava i dostiže kritični nivo, AI se akumulira do potrebnog praga i stupa u interakciju s odgovarajućim regulatornim proteinima, što dovodi do nagle aktivacije (indukcije) ekspresije određenih gena u bakterijama. Uz pomoć AI, ostvaruje se komunikacija bakterija - međućelijski prijenos informacija između jedinki bakterija koje pripadaju istoj i različitim vrstama, rodovima, pa čak i porodicama; stoga se signalni molekuli smatraju "riječima" na ovom neobičnom "jeziku" bakterija. Kroz QS regulaciju, bakterije stiču sposobnost da koordiniraju kontrolu ekspresije gena u cijeloj zajednici. U ovakvom ponašanju bakterija, karakteristike sličnosti sa višećelijskih organizama; bakterije iskorištavaju "društveno" ponašanje koje im nije bilo dostupno kao pojedinačne ćelije. Prenos informacija iz ćelije u ćeliju pomoću QS sistema, što dovodi do indukcije specijalizovanih setova gena, promoviše brzu adaptaciju populacija bakterija na promenljive uslove sredine i njihov opstanak u prirodnim uslovima.

QS regulacija je prvi put otkrivena i opisana ranih 1970-ih u svjetlećoj morskoj bakteriji Vibrio fischeri. U ovoj bakteriji je kodirana sposobnost bioluminiscencije zbog sinteze luciferaze lux operon ( luxCDABE), a bioluminiscencija se javlja samo pri velikoj gustini bakterijske populacije (do 10¹¹ ćelija/ml). V. fischeri živi u simbiozi s nekim morskim životinjama, u specijaliziranom svjetlosnom organu životinje. U ovoj simbiotičkoj zajednici, životinja domaćin daje bakteriji bogat hranljivi medij, a bakterija domaćin daje svjetlost. Svaki eukariotski organizam koristi svjetlost za svoje specifične svrhe. Na primjer, puž Eurymna scolopes osvjetljavajući se sa V. fischeri, ne baca senke na svetlosti meseca i zvezda, što joj pomaže da pobegne od neprijatelja. Riba Monocentris japonicus koristi svjetlost da privuče partnera [na 3].

Dugo se vjerovalo da je QS regulacija vrlo rijedak slučaj, međutim, posljednjih godina postalo je jasno da je ova vrsta regulacije rasprostranjena u bakterijama različitih taksonomskih grupa. Do danas je QS regulacija pronađena u više od 50 vrsta bakterija. Bakterije koriste širok spektar jedinjenja kao autoinduktori QS sistema; broj novootkrivenih AI se povećava. Istovremeno, jedna vrsta bakterija može koristiti i prepoznati više od jedne vrste signalnih molekula.

Sada se pokazalo da regulatorni sistemi tipa QS igraju ključnu ulogu u velikom broju procesa u bakterijskim ćelijama. Oni su uključeni u interakciju mnogih bakterija sa višim organizmima, životinjama i biljkama, u regulaciji virulencije bakterija, formiranju biofilma, regulaciji ekspresije gena povezanih sa sintezom raznih egzoenzima, toksina, antibiotika i drugih sekundarnih metabolita, konjugacija, itd. i proteomska analiza je pokazala da QS sistemi funkcionišu kao globalni regulatorni faktori. Proučavanje QS regulatornih sistema, njihove uloge u metabolizmu i interakciji bakterija definiše potpuno novi pristup proučavanju ponašanja bakterija u prirodnim uslovima; ove studije mogu biti od velike praktične važnosti.

Uloga QS sistema je posebno velika u regulaciji procesa interakcije između patogenih bakterija i eukariotskog organizma domaćina. Infektivni proces nastaje kada se dosegne dovoljno velike populacije patogenih bakterija; istovremeno, povećanje koncentracije signalnih molekula u mediju dovodi do sinhrone sinteze faktora virulencije koji doprinose razaranju tjelesnih tkiva. Takva strategija doprinosi uspješnom prevladavanju imunološkog odgovora organizma domaćina od strane bakterija.

Sposobnost bakterija da formiraju biofilm je bitan faktor u njihovoj patogenosti. Biofilmovi su fizičke strukture sa jedinstvenim karakteristikama koje formiraju površinski vezane mikrobne zajednice. Formiranje biofilma jedna je od glavnih strategija koje povećavaju preživljavanje bakterija u okolišu, uključujući organizam domaćina. Sposobnost bakterija da postoje u sastavu biofilma stvara velike poteškoće medicinskoj praksi, jer se time značajno povećava otpornost bakterija na djelovanje antibakterijskih lijekova, kao i na djelovanje dezinficijensa, nepovoljnih faktora okoline, kao što su niske ili visoki pH nivoi, visoka osmotska sila itd., te djelovanje imunološke odbrane organizma domaćina. Formiranje bakterijskih biofilma na implantabilnoj opremi (npr. kateteri, umjetni srčani zalisci, sočiva itd.) uzrok je niza teških kroničnih bolesti koje je izuzetno teško liječiti. Pokazalo se da regulacija QS igra ključnu ulogu u formiranju biofilma.

Činjenica da QS može biti važan faktor u regulaciji virulencije bakterija dovela je do nove linije istraživanja koja se odnose na korištenje QS regulacije kao potencijalne mete u borbi protiv zaraznih bolesti. Pretpostavlja se da supresija QS sistema može pružiti nove tretmane, što rezultira stvarnom konverzijom patogenih bakterija u nepatogene bakterije bez upotrebe uobičajeno korištenih antibiotika i drugih lijekova. Ovaj pristup se trenutno razmatra kao nova strategija antimikrobne terapije koja obećava. Veliki broj laboratorija traži i proučava supstance koje suzbijaju QS. U nastavku ćemo razmotriti poznate QS sisteme u bakterijama i izglede za stvaranje lijekova nove generacije usmjerenih direktno na suzbijanje patogenosti bakterija.

Kvorumsensing sistema u bakterijama njimamolekularni mehanizmi

njihove akcije

QSsistem gram-negativnih bakterijaLuxI- LuxRtip.

Kod gram-negativnih bakterija najbolje su proučavani QS sistemi koji funkcionišu uz učešće autoinduktora N-acil-homoserin laktona (AHL, ili AI-1). AHL uključuju homoserinski laktonski prsten i privjesne acilne grupe. Opisano je više od 40 AHL-a, koji se razlikuju po dužini acilnih lanaca u molekulu. Specifičnost djelovanja AHL-a određena je brojem acilnih grupa (od C4 do C16) i prisustvom nekih dodatnih grupa. AHL-ovi koji sadrže kratke acilne lance slobodno difundiraju kroz ćelijske membrane; AHL sa dugim acilnim lancima zahtevaju aktivan transport do izlaska iz ćelija. AHL reaguju sa regulatornim proteinima koji su homologni LuxR proteinu Vibrio fischeri, koji čine porodicu proteina sličnih LuxR-u. Molekuli ovih proteina sadrže dva domena koja određuju vezivanje proteina za AHL i DNK. Povezivanje AHL-a mijenja konfiguraciju proteina sličnog LuxR-u tako da se može vezati za DNK i funkcionirati kao aktivator transkripcije.

S-adenozil metionin (SAM) (formiranje homoserinskog laktonskog prstena) i ACP, nosač acilne grupe, uključeni su u biosintezu AHL kod nekoliko bakterija koje su proučavane u ovom pogledu.

QS sistemi koji funkcionišu uz učešće AHL nalaze se u velikom broju gram-negativnih bakterija, uključujući i rodove Agrobacterium, Aeromonas, Burkholderia, Chromobacterium, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, hafnia, pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Rhizobium, Serratia, Vibrio, Yersinia itd. Među njima su bakterije koje su patogene i fitopatogene.

Regulacija QS-a je najdetaljnije proučena. lux operon Vibrio fischeri. Uključuje dvije glavne regulatorne komponente: 1) LuxI protein (sintaza).

autoinduktor) odgovoran je za proizvodnju N-(3-oksoheksanoil)-homoserin laktona (3OC12-HSL); 2) LuxR protein veže autoinduktor, a zatim kompleks LuxR-3OC12-HSL, vezujući se za promotor lux operon, aktivira njegovu transkripciju, što dovodi do sinteze luciferaze i emisije svjetlosti. Kada je kultura Vibrio fischeri raste, 3OC12-HSL se akumulira do nivoa praga koji je dovoljan da aktivira LuxR, vezujući ga za region promotora lux operona i indukcije ovog operona. Jer gen sintaze autoinduktora LuxI je dio ovog operona, količina AI pod ovim uvjetima naglo raste, što dovodi do dalje indukcije lux sinteza operona i luciferaze.

Među patogenim bakterijama, QS sistemi su najbolje proučeni. Pseudomonas aeruginosa. U kavezima Pseudomonas aeruginosa, oportunistički ljudski patogen koji uzrokuje teške infekcije respiratornog trakta, veliki broj gena, uključujući gene odgovorne za sintezu faktora virulencije, aktiviraju dva QS sistema LuxI-LuxR tipa: LasI-LasR i RhlI-RhlR. LasI protein je odgovoran za proizvodnju autoinduktora N-3(oksododekanoil) homoserin laktona (3OC12-HSL), RhlI protein je sintaza N-butanoil-homoserin laktona (C4-HSL), učestvuje u regulaciji formiranja biofilma. LasI-LasR sistem reguliše sintezu sekretiranih faktora virulencije odgovornih za destrukciju tkiva domaćina nakon pokretanja infektivnog procesa: elastaze, kodirane genom lasB, kodirana proteaza lasA, egzotoksin kodiran toxA, alkalna fosfataza koju kodira gen aprA. LasR-LasI QS sistem takođe aktivira ekspresiju gena drugog QS sistema P. aeruginosa, RhlI-RhlR, što dovodi do njegove indukcije. RhlR proteinski kompleks sa odgovarajućim C4-HSL autoinduktorom indukuje ekspresiju dva gena regulisana QS sistemom prvog tipa, lasB I aprA, I. još nekoliko gena važnih za virulenciju bakterija i njihov opstanak u prirodnim uvjetima. Pokazalo se da je ekspresija više od 600 gena P. aeruginosa kontroliše QS.

Pokazalo se da 3OC12-HSL može imati direktan učinak na tijelo: 3OC12-HSL molekuli stupaju u interakciju sa komponentama imunološkog sistema, kao što su interleukini, modulirajući imunološki odgovor tijela na infekciju. P. aeruginosa; inhibiraju proliferaciju limfocita, diferencijaciju T-ćelija, proizvodnju citokina, smanjuju proizvodnju faktora tumorske nekroze; injekcije ovog jedinjenja izazvale su upalni proces kod miševa.

At P. aeruginosa otkriven je autoinduktor drugačije prirode - 2-heptil-3-hidroksi-4-kinolon (nazvan PQS). PQS djelimično reguliše ekspresiju gena za elastazu lasB zajedno sa dva gore opisana QS sistema. PQS ekspresija zahtijeva LasR protein, a PQS, zauzvrat, aktivira transkripciju gena rhlI.

Dakle, QS sistemi su uključeni u kontrolu virulencije P. aeruginosa u složenoj, hijerarhijskoj mreži regulacije.

Mikroskopija pluća pacijenata sa cističnom fibrozom (CF) pokazala je da P. aeruginosa tamo živi uglavnom u sastavu biofilma. Pokazalo se da ćelije P. aeruginosa, ležaj lasI mutacije, ne formiraju zrele biofilmove, formiranje biofilma prestaje u fazi mikrokolonija. Ove mutacije mogu biti dopunjene egzogenim dodatkom 3OC12-HSL autoinduktora. Istraživanje sprovedeno sa P. aeruginosa pokazalo je da stvaranje biofilma može biti najvažniji faktor u kolonizaciji pluća ovim patogenom.

Još jedna patogena bakterija u kojoj se aktivno proučava uloga QS u regulaciji virulencije je Burkholderia cepacia, sadrži CepI-CepR QS sistem uključen u regulaciju faktora patogenosti (egzoproteaze, siderofore). Sinteza QS autoinduktora regulacije N-oktanoil-homoserin laktona (C8-HSL) i N-heksanoil-homoserin laktona (C6-HSL) u ovoj bakteriji je vrlo slaba. Bio je prikazan. da su u većini slučajeva kod pacijenata sa cističnom fibrozom u isto vrijeme bila inficirana pluća B. cepacia I P. aeruginosa. U isto vrijeme, komunikacija među vrstama između ovih bakterija mogla bi povećati patogenost. B. cepacia. Dakle, dodavanje tečnosti kulture P. aeruginosa kulturama B. cepacia dovelo do značajnog povećanja aktivnosti egzoproteaze i proizvodnje siderofora. Ovo je bio prvi primjer gdje je bakterija mogla regulirati proizvodnju svojih faktora patogenosti putem sinteze AI od strane druge bakterije. Proučavanje ovakvih karakteristika ponašanja bakterija u prirodnim uslovima otvara nove aspekte koji su važni za epidemiologiju. Zaista, epidemiologija ne uzima u obzir takve sasvim moguće situacije kada interakcija nepatogenih bakterija koje proizvode AHL i slabo patogenih bakterija (ili praktički nepatogenih u datim uvjetima) može dovesti do razvoja infekcije. Trenutno dostupni podaci snažno postavljaju pitanje potrebe za ozbiljnim proučavanjem komunikacije različitih bakterija u prirodnim uvjetima i molekularnih mehanizama takve komunikacije.

QSkod Gram-pozitivnih bakterija

Kod Gram-pozitivnih bakterija, nekoliko sistema uključenih u kontrolu virulencije u Staphylococcus aureus, u regulaciji kompetencije (tj. sposobnosti prihvatanja egzogene DNK tokom transformacije) u Streptococcus pneumoniae, regulisanje kompetencije i sporulacije u bacil subtilis. Sekretirani peptidi, AIP, koriste se kao autoinduktori QS sistema kod Gram-pozitivnih bakterija. Među njima su linearni peptidi i peptidi koji sadrže tiolaktonski prsten. Prepoznaju ih specifični receptori, dvokomponentne senzorne histidin kinaze vezane za membranu. Peptidne signalne molekule ne difundiraju kroz ćelijsku membranu; Očigledno, izvoznici peptida su odgovorni za njihovo oslobađanje iz ćelije u medijum. U većini slučajeva dolazi do obrade i modifikacije peptida. Različite gram-pozitivne bakterije sintetiziraju različite peptidne signalne molekule. Mehanizam signalizacije funkcioniše kroz kaskadu fosforilacije/defosforilacije. Senzorna kinaza se fosforilira, nakon čega se fosforilna grupa prenosi na odgovarajući protein - regulator odgovora. Fosforilirani regulator odgovora se vezuje za DNK i aktivira transkripciju ciljnog gena.

Najbolje proučavan sistem je QS Staphylococcus aureus. S. aureus koristi dvofaznu strategiju za infekciju domaćina. Pri niskoj gustini naseljenosti bakterija (prva faza infekcije), stanice proizvode proteinske faktore koji pospješuju njihovo vezivanje i kolonizaciju; pri velikoj gustoći naseljenosti (druga faza), bakterije potiskuju sintezu ovih faktora i u njima počinje lučenje toksina i proteaza; ova faza je regulisana Agr QS sistemom. Sistem uključuje autoinduktorski peptid AIP i agrBDCA-operon. Gene agrD kodira AIP, gene agrC I agrA- dva dvokomponentna proteina, senzor kinaze, AgrC i AgrA. Gene agrB kodira protein koji izvozi i modificira AIP (dodaje tiolaktonski prsten). Vezivanje AIP za AgrC dovodi do fosforilacije AgrA. Fosforilisani AgrA indukuje ekspresiju regulatorne RNK (RNAIII), koja potiskuje ekspresiju faktora ćelijske adhezije tokom druge faze infekcije. Aktivirani AgrA takođe izaziva ekspresiju agr operon, koji izaziva indukciju sinteze AIP.

Poznate su četiri grupe S. aureus, sintetizirajući AIP-ove s različitim sekvencama. Zanimljivo je da svaki tip AIP-a aktivira sopstveni AgrC receptor, ali inhibira aktivaciju receptorskih proteina u ostale tri grupe zbog kompetitivnog vezivanja za ove proteine; kao rezultat toga, AIP svake grupe stafilokoka potiskuje aktivaciju kaskade virulencije preostale tri grupe S. aureus. U skladu sa ovom strategijom, pročišćeni stafilokokni AIP II peptid suzbija virulenciju S. aureus grupa I kod infekcije miševa.

Drugi QS mehanizam, koji funkcioniše u S. aureus, uključuje RAP protein (aka ribosomalni L2 protein) i TRAP protein; potonji je citoplazmatski transkripcijski faktor. TRAP u fosforilisanom stanju aktivira RNK III; njegovu fosforilaciju stimuliše RAP protein. Virulencija S. aureus može inhibirati RIP peptid (RNA III inhibirajući peptid). RIP peptid inhibira fosforilaciju TRAP proteina, što dovodi do inhibicije sinteze RNK III, što dovodi do supresije sinteze toksina i smanjenja virulencije ćelije. Fosforilacija TRAP-a takođe može biti inhibirana u prisustvu AIP-a; ovo pokazuje da je složena mreža transdukcije signala uključena u regulaciju patogeneze S. aureus.

Kod ostalih gram-pozitivnih bakterija, streptomiceta, među kojima su glavni proizvođači antibiotskih supstanci koje se koriste u medicini, jedinjenja različite prirode, γ-butirolaktoni, koriste se kao autoinduktori QS sistema. QS u ovim bakterijama je uključen u regulaciju njihove morfološke diferencijacije i proizvodnju sekundarnih metabolita. Zanimljivo je da su signalne molekule streptomiceta strukturno slične N-acil0-homoserin laktonima gram-negativnih bakterija. Međutim, nije poznato postoji li komunikacija u prirodi između ovih taksonomski udaljenih grupa bakterija koje koriste ove signalne molekule.

QSautoinduktorski sistemAI-2

AI-2 autoinduktor je prvi put otkriven u ćelijama Vibrio harveyi; to je spoj neobične strukture, furanozil boratni diester. AI-2 se akumulira u drugoj polovini faze eksponencijalnog rasta, ali njegov sadržaj naglo opada kada kultura uđe u stacionarnu fazu.

AI-2 sintaza je LuxS protein kodiran genom luxS; geni luxS visoko homologan među bakterijama. U stvari, gen luxS prisutan u polovini svih sekvenciranih bakterijskih genoma.

AI-2 se proizvodi iz S-adenozilmetionina kroz tri koraka; Supstrat za LuxS sintazu je S-adenozil-homocistein, koji se dalje pretvara u adenin, homocistein i 4,5-dihidroksi-2,3-pentandion (DPD). Od DPD-a, visoko reaktivnog proizvoda koji se lako preuređuje i ulazi u dodatne reakcije, mogu se formirati signalne molekule koje različite vrste bakterije su prepoznate kao AI-2. Nedavno je utvrđena struktura još jednog signalnog molekula, AI-2 Salmonella typhimurium; ova supstanca furanske prirode razlikuje se od AI-2 V. harveyi, uključujući, ne sadrži atom bora. Pokazalo se da ova dva AI-2 i njihovi prekursori izvedeni iz DPD-a mogu biti u ravnoteži u prirodnim uslovima i lako se međusobno pretvaraju. Pretpostavlja se da je pojava bora u molekulu AI-2 V. harveyi može biti zbog visoke koncentracije ovog elementa u morskoj vodi, gdje ova bakterija živi; istovremeno, njegova koncentracija u staništu S. typhimurium mnogo niže. Prisustvo bora u molekulu AI-2 V. harveyi i njegovo odsustvo u AI-2 S. typhimurium, očigledno neophodni za djelovanje ovih autoinduktora u stanicama organizama koji ih proizvode.

Tako su ove još malobrojne studije QS sistema, uključujući autoinduktori tipa AI-2, pokazale da, koristeći konzervativni biosintetski put koristeći enzim LuxS, bakterije sintetiziraju međuprodukte signalnih molekula, čija se daljnja sudbina može odrediti karakteristike životne sredine.

At Vibrio harveyi protein senzora receptora je LuxP, koji direktno vezuje AI-2. LuxP-AI-2 kompleks stupa u interakciju sa histidin kinazom LuxQ vezanom na membranu. Pri niskoj gustini bakterijske populacije, LuxQ se fosforilira i fosfat se prenosi na citoplazmatski LuxU protein, a zatim iz ovog proteina na regulatorni protein LuxO koji se vezuje za DNK. Zatim se dešava složeni lanac događaja, uključujući aktivaciju gena koji kodiraju pet malih regulatornih RNK ​​pomoću fosfo-LuxO proteina i sigma 54 podjedinice RNA polimeraze; ove RNK stupaju u interakciju sa Hfq RNA šaperon proteinom, što rezultira vezivanjem i destabilizacijom mRNA koja kodira LuxR aktivator transkripcije. LuxR je potreban za aktivaciju transkripcije lux operon Vibrio harveyi; pri niskoj gustoći populacije bakterija mRNA luxR degradira i kao rezultat nema bioluminiscencije. Pri visokoj gustoći populacije bakterija, količina AI-2 se jako povećava, što dovodi do defosforilacije LuxO proteina. Nefosforilirani LuxO ne može inducirati ekspresiju malih regulatornih RNK. Kao rezultat, translacija mRNA postaje moguća. luxR, LuxR sinteza proteina i bioluminiscencija. Dakle, akumulacija AI-2 na kraju uzrokuje aktivaciju ekspresije gena lux operon. Od velikog interesa je činjenica da je u uredbi lux operon V. harveyi Učestvuju tri tipa autoinduktorskih QS sistema koji međusobno deluju: AI-2, AHL (tab.) i CAI-1.

Trenutno, pitanje uloge AI-2 kao signalnog molekula i regulatora ekspresije gena u različitim bakterijama ostaje nedovoljno proučeno i zahtijeva daljnja istraživanja.

Što se tiče patogenih bakterija na temelju proučavanja mutanata s inaktiviranim genom lux S, ovaj gen, za koji se smatra da je gen AI-2 sintaze, pokazalo se da je uključen u regulaciju ekspresije gena povezanih sa virulentnošću enteropatogenih sojeva. E. coli, Vibrio kolera, Streptococcus pyogenes. QS sistemi ovog tipa su globalni regulatori ekspresije bakterijskih gena; pa se pokazalo da lux S je uključen u regulaciju transkripcije 242 gena E. coli, što čini 5,6% genoma ove bakterije.

Među bakterijama porodice Enterobacteriaceae Sistemi QS tipa II su najbolje proučavani E. coli I S. typhimurium. At S. typhimurium geni koji kodiraju tip AI-2 receptora različit od AI-2 LuxP receptora su pronađeni u V. harveyi. To je ATP-ovisni transporter pod nazivom LsrB (za LuxS reguliran). Isti AI-2 receptor pronađen je i kod drugih članova porodice Enterobacteriaceae. Jednom u ćeliji, AI-2 se fosforilira i vezuje za LsrR protein. U nedostatku AI-2, LsrR protein potiskuje lsr operon. AI-2 se akumulira u drugoj polovini faze eksponencijalnog rasta, njegov sadržaj u mediju naglo opada kada kultura uđe u stacionarnu fazu. Ćelije E. coli I S. typhimurium uvoz AI-2 pri prelasku u stacionarnu fazu pomoću Lsr transportera.

Zasnovano na proučavanju efekta mutacija koje inaktiviraju gen lux S, zaključeno je da je LuxS sintaza uključena u regulaciju ekspresije gena povezanih s virulencijom kod patogenih sojeva E. coli EHEC i EPEC - kontroliše ekspresiju sekrecionog sistema tipa III, koji je kodiran genima LEE lokusa, uključen je u regulaciju migracije ćelija, formiranje biofilma, sintezu toksina itd. Analiza transkriptoma je pokazala da LuxS je globalni regulator EHEC-a koji kontrolira ekspresiju više od 400 gena. Objavljena je velika količina podataka koji pokazuju da su mutacije u genu lux S dovode do odsustva sinteze AI-2 i imaju značajan uticaj na ćelijske procese različitih bakterija iz porodice Enterobacteriaceae: S. marcescens, Serratia sp. , Erwinia carotovora I amylovora.

Međutim, u eksperimentima komplementacije, mutacije u genu lux S kada se koristi izolovani i hemijski sintetizovani AI-2, ustanovljeno je da svi fenotipovi ne zavise od lux S , kontroliše direktno AI-2. Regulatorna uloga AI-2 Tačno dokazana za bioluminiscencijski soj V. harveyi BB170 i izraz lsr-operon y S. typhimurium. Ovi rezultati ukazuju na to da treba preispitati podatke o uticaju AI-2 na neka svojstva ćelija za koje se ranije smatralo da zavise od QS sistema tipa II, uzimajući u obzir da sinteza AI-2 nije jedina funkcija LuxS sintaze. U bakterijskim ćelijama sa inaktiviranim genima lux S akumulira S-ribozil-homocistein, jer se dalje ne cijepa na homocistein i DPD. U ovom slučaju, nivo homocisteina, koji je neophodan za sintezu metionina, naglo se smanjuje u ćeliji, a ćelija će koristiti druge načine svog formiranja, posebno kroz oksaloacetat. Dakle, promjene u ekspresiji različitih gena u lux S-mutanti se mogu odrediti ne (ili ne samo) QS-regulacijom, već i ozbiljnim poremećajima u metabolizmu bakterija, što uzrokuje pleiotropne efekte.

Da odgovorim na pitanje da li uticaj lux S-mutanti za različite bakterijske fenotipove uz odsustvo funkcionisanja QS-sistema baziranih na AI-2, ili je to rezultat pleiotropnih efekata kod metaboličkih poremećaja, izvršena je analiza genomskih baza podataka na prisustvo gena poznatih. AI-2 receptori (LuxP receptor Vibrio harveyi i Lsr receptor S. typhimurium) Sugerirano je da je ovisnost fenotipova o regulaciji QS tipa II ograničena pretežno na organizme koji nose gene receptora AI-2 i fenotipske varijacije u lux S mutanti koji ne sadrže ove gene mogu se objasniti poremećajima u staničnom metabolizmu. Genomska analiza je omogućila da se utvrdi prisustvo Lsr-sličnih AI-2 receptora kod članova porodice Enterobacteriaceae, kao što je E. coli, Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae,Yersinia spp., Shigella dysenteriae I Shigella flexneri, Salmonella spp.

Homolozi poznatih AI-2 receptora nisu pronađeni u objavljenim bankama sekvenci gena i proteina bakterija iz roda Serratia I Erwinia. Iako nije iznenađujuće, izostanak dvokomponentne senzorne kinaze LuxPQ (ovaj receptor je do sada pronađen samo kod članova porodice). Vibrionaceae), odsustvo Lsr-receptorskog kompleksa u genomu ovih bakterija je bilo iznenađenje. Ova činjenica izaziva ozbiljne sumnje u postojanje u njima QS sistema koji funkcionišu uz učešće AI-2 i sugeriše pretežno metaboličku ulogu LuxS u ovim bakterijama. Iako se, naravno, ne može isključiti mogućnost da još nisu proučavali AI-2 receptore.

Dakle, funkcije tvari tipa AI-2 mogu biti različite u različitim bakterijama. Međutim, čak i u onim slučajevima kada ove supstance u sastavu QS sistema nisu regulatori ekspresije gena ćelije domaćina, one mogu, oslobađajući se u životnu sredinu, učestvovati u regulaciji ćelijskih procesa drugih bakterija u populaciji, vršeći svoje komunikacija. Slični odnosi su prikazani za umjetne miješane bakterijske populacije koje se sastoje od stanica E. coli I V. harveyi, kao i V. kolera, koji može koegzistirati sa E. coli u ljudskom tijelu.

QS sistemi koji koriste autoinduktorAI-3 i hormoni

AI-3 je prvi put opisan kao komponenta korištenog medija za kulturu soja EHEC patogena, koji je aktivirao ekspresiju gena odgovornih za prianjanje bakterija na eukariotske stanice. Eksperimenti na proučavanju strukture AI-3 pokazali su da je ovaj spoj aromatičan po prirodi, sugerirano je da je priroda aminokiselina AI-3. Međutim, kompletna struktura i mehanizam sinteze ovog signalnog molekula još nije utvrđen. Pretpostavlja se da, kao iu slučaju AHL-a, postoji čitava porodica jedinjenja sličnih AI-3. Pokazalo se da je sinteza AI-3 nezavisna od gena lux S in E. coli, za razliku od sinteze AI-2. Utvrđeno je da AI-3 aktivira transkripciju gena virulencije LEE lokusa u EHEC sojevima E. coli. Za određivanje AI-3 dobijeni su biosenzori - sojevi E. coli K-12 koji sadrži konstrukte u hromozomu na osnovu gena LEE lokusa i reporterskog gena lac Z. Uz pomoć biosenzora utvrđeno je da različite bakterije crijevne mikroflore, nepatogeni sojevi E. coli I Enterobacter cloacae i patogene vrste Shigella, Salmonella I Klebsiella, sintetizirati

Da bi AI-3 funkcionirao E. coli neophodan je dvokomponentni sistem, uključujući senzorsku kinazu QseC i regulator odgovora QseB. U prisustvu AI-3 u periplazmatskom prostoru, QseC se prvo fosforilira, a zatim prenosi fosfat na QseB, koji se vezuje za odgovarajuće promotore i aktivira ekspresiju sopstvenog gena i gena. flhDC-operon odgovoran za sintezu flagela. AI-3 je također uključen u regulaciju gena LEE lokusa. Utvrđeno je da je dvokomponentni sistem, nazvan QseEF, odgovoran za regulaciju ovih gena.

QseCB i QseEF sistemi, pored AI-3, odgovaraju na drugu klasu signalnih molekula, kateholaminskih hormona, posebno epinefrina/noradrenalina (ili epinefrina/noradrenalina), koje sintetiše organizam domaćina. Analiza bakterijskih genoma pokazala je da su signalne kaskade AI-3/epinefrin/noradrenalina prisutne u velikom broju bakterijskih vrsta.

QSi apoptoza kod bakterija.

Pored prethodno opisanih QS sistema, E. coli otkriven je QS sistem koji funkcioniše uz učešće peptida kao signalnih molekula, koji je uključen u regulaciju bakterijske apoptoze. Apoptoza ili programirana ćelijska smrt (PCD) je genetski determinisani program ćelijske smrti u višećelijskim eukariotskim organizmima. PKC doprinosi normalnom funkcionisanju biološkog sistema, oslobađajući ga od oštećenih ćelija koje su završile svoj životni ciklus ili se pojavljuju kao rezultat mutacija potencijalno opasnih ćelija. Sistemi sa sličnom funkcijom pronađeni su i kod prokariota. Smrt dijela stanične populacije može se smatrati prokariotskim analogom apoptoze. bakterije u uslovima zastoja rasta populacije, na primer, u stacionarnoj fazi rasta kada je hranljivi supstrat iscrpljen ili pod uticajem faktora stresa. Kao rezultat odumiranja i autolize nekih stanica, preostale žive stanice mogu koristiti proizvode autolize kao hranjivi supstrat i nastaviti rasti, sintetizirajući potrebne stanične komponente, što je korisno za opstanak bakterijskih populacija. PCD može olakšati razmjenu genetskih informacija u bakterijskoj populaciji oslobađanjem DNK kao rezultat lize stanica. Osim toga, uništavanje stanica s oštećenjem genetskog aparata također je korisno za populaciju bakterija.

Genetski mehanizmi PCD u prokariotskim sistemima nisu u potpunosti razjašnjeni. Mnogo pažnje je posvećeno proučavanju toksin-antitoksin sistema (TA-sistema) pronađenih u E. coli i druge bakterije. TA moduli se sastoje od para gena u bakterijskim genomima: gena koji kodira stabilan toksin koji uzrokuje smrt ćelije i gena koji kodira labilni antitoksin koji inhibira aktivnost toksina; geni toksina su ko-transkribovani sa genima odgovarajućih antitoksina unutar istog operona.

Sistem E. coli maz EF je jedan od najviše proučavanih TA sistema. Gene maz F kodira stabilan citotoksični protein, i maz E je nestabilni antitoksin koji se razgrađuje od strane ATP-ovisne ClpAP serinske proteaze. MazF toksin je endoribonukleaza koja prvenstveno cijepa jednolančane mRNA u ACA sekvenci i također djeluje na 16S RNK u centru za dekodiranje 30S podjedinice ribozoma, što rezultira inhibicijom sinteze proteina. Sve dok su MazE i MazF ko-eksprimirani, MazE stupa u interakciju s MazF-om kako bi neutralizirao njegove toksične efekte. U normalno rastućim stanicama, toksin i antitoksin formiraju stabilan kompleks, koji sprečava toksin da ostvari svoj toksični učinak. U stresnim uslovima koji sprečavaju izražavanje maz EF operon, proteaze izazvane stresom razgrađuju MazE, i kao rezultat toga, stabilan MazF toksin može djelovati na ćelijske RNK, što dovodi do smrti stanice i autolize većine populacije.

maz EF-posredovana apoptoza zavisi od gustine populacije, regulisana je QS-faktorom EDF (ekstracelularni faktor smrti, ekstracelularni faktor smrti). EDF je linearni Asn-Asn-Trp-Asn-Asn pentapeptid. Utvrđeno je da EDF povećava aktivnost MazF-a in vitro. U isto vrijeme, aktivacija MazF-a dovela je do povećanja sinteze EDF-a, što je zauzvrat uzrokovalo povećanje stanične smrti u uvjetima stresa. Pronađeno je direktno vezanje EDF i MazF specifično za mjesto. Rezultati sprovedenih studija pokazuju da je QS sistem uključen u regulaciju apoptoze u E. coli, fundamentalno se razlikuje od QS sistema opisanih gore Enterobacteriaceae: 1) EDF je jedini peptidni signalni molekul koji se nalazi u njemu E. coli; 2) većina poznatih molekula uključenih u funkcionisanje QS kontrolne ekspresije gena na transkripcionom nivou i EDF na post-transkripcionom nivou.

Nedavno je otkriveno nekoliko malih QS peptida koji se razlikuju u sekvenci aminokiselina od EDF sintetiziranog gram-negativnom bakterijom. Pseudomonas aeruginosa i gram pozitivni bacil subtilis, koji bi mogao biti uključen u regulaciju ćelijske smrti koju kontrolira maz EF . Svaki od ovih peptida, uprkos razlikama u strukturi, aktivirao je endoribonukleolitičku aktivnost MazF-a. E. coli, očigledno u interakciji s različitim mjestima na ovom proteinu. Tako je otkrivena QS porodica EDF peptida, koja kasnije može postati osnova za dobijanje nove vrste regulatora koji aktiviraju PKC.

Gore navedeni QS sistemi i autoinduktori uključeni u njihovo funkcionisanje ne iscrpljuju sve trenutno poznate; broj novootvorenih se stalno povećava.

inhibicijaQSsistemi bakterija - novi pristup stvaranju lijekova protiv patogenosti

Jedan od najvažnijih problema moderne medicine je sve veće širenje bakterijskih patogena otpornih na tradicionalne lijekove. Ovaj problem posebno jasno ilustruje široka rasprostranjenost bolničkih infekcija, koje se danas u jedinicama intenzivne njege bilježe kod više od 20% pacijenata. Širenje oblika patogenih bakterija otpornih na lijekove, što umanjuje djelotvornost i deprecira sve veći broj uobičajenih tradicionalnih lijekova, te potreba za razvojem metoda za suzbijanje stvaranja biofilma bakterijama postavlja pitanje novih strategija za suzbijanje zaraznih bolesti. , stvaranje lijekova nove generacije koji utiču na specifične biohemijske sisteme mikroorganizama.

Trenutno je općeprihvaćeno da je jedna od najperspektivnijih "meta" ove vrste regulativa Quorum Sensing. QS sistemi, kao što je gore navedeno, uključeni su u regulaciju virulencije bakterija i njihovo formiranje biofilma.

Predlaže se da se lijekovi koji imaju za cilj suzbijanje QS sistema nazivaju "otrovi patogenosti", jer. oni, za razliku od klasičnih antimikrobnih lijekova (prvenstveno antibiotika), nemaju baktericidno ili bakteriostatsko djelovanje na patogene bakterije i stoga ne stvaraju selektivni pritisak koji vodi do stvaranja oblika patogenih bakterija otpornih na antibakterijske tvari. Nedavno su u inostranstvu formirane biotehnološke kompanije koje imaju za cilj razvoj agenasa koji inhibiraju QS regulaciju i kao rezultat toga smanjuju patogenost bakterija i sprečavaju njihovo stvaranje biofilma.

Suzbijanje funkcionisanja QS sistema može se postići na više načina.

1. Suzbijanje sinteze autoinduktora QS sistemi.

Kao što je gore pomenuto, S-adenozilmetionin (SAM) je supstrat za sintezu autoinduktora AHL i AI-2 QS sistema dva tipa. Pokazalo se da su različiti analozi SAM-a, na primjer, S-adenozilhomocistein, S-adenozilcistein, djelovali kao jaki inhibitori AHL sinteze u Pseudomonas aeruginosa. Treba napomenuti da se čini da se interakcija AHL sintaze sa SAM javlja na vrlo specifičan način, uprkos činjenici da je SAM čest prekursor u mnogim biohemijskim putevima prokariota i eukariota. Ovo nam omogućava da se nadamo da se SAM analozi mogu koristiti kao specifični inhibitori sinteze autoinduktora bakterijskih QS regulatornih sistema koji ne utiču na eukariotske enzime.

Pokazalo se da neki antibiotici - makrolidi, inhibitori sinteze proteina na nivou ribosoma, potiskuju sintezu AHL i nekih faktora virulencije u koncentracijama koje ne inhibiraju rast bakterija. Na primjer, subinhibitorne koncentracije eritromicina potisnu sintezu faktora virulencije AHL i hemolizina, proteaza i hemaglutinina u Pseudomonas aeruginosa. Bakterije tretirane antibioticima bile su manje virulentne kod miševa. Ovi podaci su bili u skladu s rezultatima kliničkih opservacija koje pokazuju učinkovitost primjene niskih doza eritromicina i drugih makrolida kod infekcija uzrokovanih sojevima. P. aeruginosa, otporan na ove antibiotike. Azitromicin u koncentraciji od 2 μg/ml, ne inhibira rast P. aeruginosa, inhibirao sintezu AHL-a, kao i proizvodnju faktora virulencije elastaze i ramnolipida. Istovremeno, dodavanje AHL u kulturu egzogeno je dovelo do obnavljanja proizvodnje ovih faktora virulencije, pokazujući da je sinteza AHL bila primarna meta antibiotika. Mehanizam djelovanja makrolidnih antibiotika na sintezu AHL za sada ostaje nejasan.

2. Inhibicija vezivanja autoinduktora za odgovarajuće

regulatorni proteini .

Supresija funkcionisanja regulacionih sistema QS može se postići korišćenjem molekula antagonista autoinduktora koji ometaju vezivanje AI za molekule proteina receptora. Pokazalo se da takvi inhibitori mogu da se takmiče sa AHL-om; u ovom slučaju oni su strukturno slični molekulu signala autoinduktora i vezuju se za AHL vezujuće mesto proteina receptora, ali ne aktiviraju ovaj protein. Nekompetitivni inhibitori mogu imati malo ili nimalo sličnosti sa AHL; ova jedinjenja se vezuju za različita mesta na receptorskom proteinu. Trenutno se takvi inhibitori aktivno proučavaju; potraga za konkurentnim inhibitorima se vrši korišćenjem kompjuterskog dizajna.

Dobijeni su podaci o inhibiciji QS regulacije od strane AHL analoga koji nose modifikacije u različitim dijelovima AHL molekula - u acil lancima i homoserin laktonskom prstenu. Pokazalo se da je dužina acilnog lanca ključna za aktivnost AHL-a. AHL analozi sa dužim acilnim lancima od nativnog AHL mogu biti inhibitori aktivnosti QS sistema. Zamjena 3-okso grupa u AHL molekulima sa 3-hidroksil ili metil grupama, uvođenje nezasićenih veza u acilne lance dovodi do značajnog smanjenja aktivnosti AHL-a.

Modifikacije u homoserin laktonskom prstenu AHL molekula značajno utiču na njihovu aktivnost. Prirodni AHL su l-izomeri; d-izomeri generalno ne pokazuju biološku aktivnost. Čini se da je prisustvo acilnog lanca bitno za biološku aktivnost AHL-a. Zamjena homoserin laktonskog prstena s homocisteinskim laktonom jedan smanjila je aktivnost AI za red veličine, a zamjena homoserin laktamskim prstenom rezultirala je izostankom aktivacijskih ili antagonističkih svojstava ove molekule. Međutim, molekuli u kojima je homoserin lakton zamijenjen homoserin tiolaktonom mogu zadržati aktivnost tokom funkcionisanja nekih QS sistema.

Prilikom proučavanja djelovanja analoga AHL Las sistema P. aeruginosa sa supstitucijama u homoserin laktonskom prstenu, pokazalo se da je odnos prema ovim supstitucijama različit u slučaju interakcije ovih analoga sa RhlR i LasR proteinima. Ova činjenica može ukazivati ​​na dva receptorska proteina P. aeruginosa značajno se razlikuju u

njihova AHL vezujuća mjesta.

U posljednje vrijeme se velika pažnja poklanja prirodnim QS antagonistima autoinduktora, derivatima furanona, uključujući i halogenirane. Utvrđeno je da australske crvene alge Delisea pulchra sintetizira različite vrste halogeniranih furanona; njihovom proizvodnjom onemogućava se kolonizacija ove alge morskim bakterijama, u kojima je QS sistem uključen u regulaciju metaboličkih procesa, te tako štiti biljke od djelovanja bakterija. Furanones D. pulchra sadrže furanski prsten sa acilnim lancem supstituiranim na poziciji C-3 i atome broma na poziciji C-4. Zamjene na poziciji C-5 mogu varirati. Furanoni iz prirodnih izvora su halogenirani na različitim pozicijama atomima broma, joda ili hlora.

Nakon otkrića efekta nastali su furanoni D. pulchra, u različitim laboratorijama, sprovedeno je široko ispitivanje supstanci prirodnog porekla i proizvodnja hemijski sintetizovanih supstanci, derivata furanona, QS inhibitora. Među njima su bili derivati ​​furanona sa acilnim lancima različite dužine. Pokazalo se da je čak i derivat furanona bez acilnog lanca sa dva atoma broma inhibitor QS sistema. P. aeruginosa. Utvrđeno je da derivate furanona proizvode različiti organizmi: morske zelene, crvene i smeđe alge, gljive, ascidije, aktinomicete itd.

Proučavanje mehanizma delovanja ovih supstanci na QS sistem je pokazalo da se jedinjenja furanonske prirode takmiče sa AHL za mesto vezivanja za proteine ​​receptora tipa LuxR. Vezivanje furanona za receptorski protein utiče na stabilnost kompleksa protein-ligand, što dovodi do brzog cijepanja receptorskog proteina.

Djelovanje furanona rezultiralo je inhibicijom ćelijskih procesa reguliranih QS: bioluminiscencijom Vibrio fischeri; proizvodnju faktora virulencije, uključujući formiranje biofilma, i patogenezu P. aeruginosa; virulencija Erwinia carotovora. Mnogi hemijski sintetisani furanoni bili su mnogo efikasniji od prirodnih. Od velikog je interesa činjenica da su sintetički furanoni bili aktivni protiv bakterija u biofilmima u istim koncentracijama kao i protiv QS regulacije planktonskih bakterija, za razliku od djelovanja klasičnih antibiotika koji se koriste u borbi protiv infekcija. P. aeruginosa; u potonjem slučaju, koncentracija antibiotika tokom rasta bakterija u biofilmima trebala je biti 100-1000 puta veća.

Upotreba transkriptomske analize omogućila je da se utvrdi da dodavanje jedinjenja furanona ćelijama utiče na ekspresiju 93 gena. P. aeruginosa PAO1; funkcionisanje 80% ovih gena je regulirano uz učešće QS sistema, na primjer, gena koji kodiraju elastazu, LasA proteazu uključenu u sintezu ramnolipida, fenazina, cijanida i hitinaze.

Nedavno je pokazano da alge proizvode derivat furanona D. pulchra, (5Z)-4-bromo-5-(bromometilen)-3-butil-2(5H)-furanon, inhibirao QS u ćelijama Escherichia coli uz učešće autoinduktora AI-2; ovo jedinjenje takođe inhibira stvaranje biofilma i potiskuje 56 gena E. coli, od kojih je 79% izazvano AI-2. Pod dejstvom ovog jedinjenja, ekstracelularna koncentracija AI-2 je prepolovljena; pretpostavlja se da je ovaj efekat izveden na post-transkripcionom nivou.

Navedeni podaci pokazuju da su derivati ​​furanona perspektivni za pripremu terapijskih sredstava na njihovoj osnovi protiv patogenosti bakterija. Međutim, trenutno testirana jedinjenja sa inhibitornim dejstvom QS regulacije su toksična za medicinsku upotrebu. Hitan zadatak je njihova modifikacija i potraga za novim, netoksičnim supstancama za praktičnu upotrebu.

Bakterije i eukariotski organizmi proizvode supstance različite prirode koje potiskuju QS regulaciju u bakterijama – ciklične dipeptide (diketopiperazine); gore su pomenuta kao jedinjenja koja mogu da aktiviraju QS sistem. Također se smatra da stupaju u interakciju sa AHL veznim mjestima na receptorskim proteinima.

3. Degradacija AHL .

Degradacija autoinduktora QS sistema je jedan od obećavajućih načina za borbu protiv bakterijskih infekcija regulisanih ovim sistemima. Degradacija AHL-a može biti posljedica djelovanja specifičnih enzima bakterija i viših organizama; osim toga, mogu se razgraditi kao rezultat alkalne hidrolize, pri visokom pH, at povišena temperatura rastuće bakterije. Trenutno je u toku aktivni skrining enzima koji razgrađuju AHL, prvenstveno laktonaza koje razgrađuju homoserinski laktonski prsten.

Laktonaze ​​koje hidroliziraju AHL pronađene su u bacilima; odgovarajući protein je nazvan AiiA. Pokazalo se da prisustvo ovog enzima u bakterijskim ćelijama u velikoj meri određuje njihovu sposobnost supresije fitopatogenih bakterija, kod kojih virulenciju regulišu QS sistemi uz učešće AHL. Transfer rekombinantnog gena AHL-laktonaze ​​u ćelije Pseudomonas fluorescens povećana sposobnost soja za biokontrolu biljnih bolesti uzrokovanih fitopatogenim bakterijama. Štaviše, pokazalo se da transgene biljke koje sadrže uneseni gen aiiA, izražene u biljci bile su značajno manje podložne infekciji Erwinia carotovora. Uvođenje gena aiiA u ćelije ovog fitopatogena smanjena je sinteza AHL i, kao rezultat, smanjena aktivnost pektolitičkih enzima i ispoljavanje drugih simptoma truleži biljaka. Također se istražuje potencijal AHL acilaza koje proizvode bakterije da razgrađuju AHL.

Viši organizmi također pokazuju mehanizme za specifičnu degradaciju AHL-a. Od velikog interesa su dokazi da epitelne ćelije ljudskih disajnih puteva mogu inaktivirati AHL. P. aeruginosa– 3OC12HSL, ali ne i C4-HSL. Čini se da je ova inaktivacija enzimske prirode. Ostali AHL-i su također degradirani, kao što je C6-HSL. Sposobnost razgradnje AHL pronađena je u nekim, ali ne u svim ćelijama sisara. Ovo otkriće otvara novo područje istraživanja i budi nadu da ljudsko tijelo ima još jednu liniju odbrane od bakterijskih infekcija - kroz interakciju s QS regulacijom bakterijske virulencije.

Potraga i proučavanje enzima koji razgrađuju autoinduktori QS sistema je novi obećavajući način za dobijanje terapijskih sredstava za borbu protiv bakterijskih infekcija.

4. Suzbijanje QS sistema gram-pozitivnih bakterija.

Virulencija Staphylococcus aureus, koje kontrolišu QS sistemi, mogu biti inhibirani prirodnim RIP peptidima, njihovim hemijski sintetizovanim analozima i himernim peptidima. Ovi peptidi se takmiče sa RAP peptidom inhibirajući fosforilaciju TRAP proteina i, kao rezultat, potiskuju sintezu RNAIII, što dovodi do inhibicije virulencije bakterija. Pokazalo se da RIP peptidi inhibiraju stvaranje biofilma in vivo. S. aureus I S. epidermidis. Efikasnost peptida pokazala se kada su korišteni kao model različitih životinja zaraženih s S. aureus. Istovremena upotreba RIP peptida i antibiotika dala je sinergistički učinak, što je rezultiralo 100% preživljavanjem miševa zaraženih S. aureus. Takođe je moguće koristiti inhibitorni efekat AIP-a na QS S. aureus, šta je gore rečeno.

Dobijeni podaci potvrđuju potencijalnu upotrebu peptida u interakciji sa QS sistemima stafilokoka u borbi protiv kliničkih infekcija uzrokovanih ovim bakterijama. Drugi pristup za antibakterijsku terapiju gram-pozitivnih bakterija je vakcinacija organizma proteinima - komponentama QS sistema. Na primjer, pokazalo se da vakcinacija miševa RAP proteinom štiti od infekcije. S. aureus.

Zaključak

Intenzivne studije regulacije Quorum Sensing sprovedene posljednjih godina pokazale su da QS sistemi sprovode globalnu regulaciju velikog broja ćelijskih procesa u bakterijama različitih taksonomskih grupa. Čini se da je ova vrsta regulacije široko rasprostranjena kod bakterija. Pronađen je širok spektar regulatora niske molekularne težine sa različitim strukturama uključenih u procese regulacije QS; povećava se broj identifikovanih jedinjenja slične aktivnosti. Regulacija QS svakako zahtijeva detaljne i dubinske studije. malo proučavano molekularni mehanizmi funkcioniranje QS sistema različitih tipova; u mnogim slučajevima nije jasno koja svojstva bakterija kontrolišu ovi regulatori; QS sistemi i njihova uloga u metabolizmu bakterija proučavani su samo za mali broj bakterija.

Nedavno je pokazano da autoregulatori QS sistema funkcionišu ne samo u bakterijama – njihov uticaj na ćelijske procese otkriven je i kod eukariotskih organizama. Iznad, direktan uticaj 3OC12-HSL (AHL uključen u regulaciju virulencije P. aeruginosa) o nekim svojstvima ćelija sisara. Utvrđeno je da biljni organizam ( Medicago truncatula) je sposoban da odgovori na bakterijske AHL (3OC12-HSL i 3OC16-HSL proizvedene od strane patogena, respektivno P. aeruginosa i biljni simbiont Sinorhizobium meliloti). Koristeći proteomiku, utvrđeno je da ovi AHL izazivaju globalne promjene u proizvodnji više od 150 biljnih proteina. Osim toga, inducirali su biljno lučenje tvari koje bi mogle stupiti u interakciju s bakterijskom regulacijom QS, inhibirajući ili stimulirajući QS.

Po svemu sudeći, eukariotski organizmi, biljke i životinje, u procesu evolucije stekli su sposobnost prepoznavanja QS signala i reagiranja na njih, proizvodeći tvari strukturno slične ovim signalnim molekulama i koje su im konkurenti, kao i sintetizirajući enzime koji uništavaju ove signalne molekule. Eukarioti mogu koristiti prirodne terapijske strategije protiv kolonizacije i invazije patogenih bakterija, što rezultira inhibicijom QS procesa.

Navedeno ukazuje da proučavanje sistema regulacije QS predstavlja novo široko polje aktivnosti istraživača u različitim oblastima biologije i medicine; ovaj fenomen zaslužuje najveću pažnju istraživača. Identifikacija i proučavanje QS sistema različitih mikroorganizama može otvoriti mnoge nove stvari u regulaciji ćelijskih procesa.

Posebna pažnja posvećena je proučavanju učešća QS sistema u regulaciji procesa povezanih sa patogenošću bakterija. Kao što je gore prikazano, suštinska uloga QS u regulaciji sinteze faktora virulencije u bakterijama otvara mogućnost fundamentalno novog pristupa stvaranju lijekova za antibakterijsku terapiju - lijekova koji imaju za cilj direktno suzbijanje QS regulacije i kao rezultat toga , suzbijanje patogenosti bakterija. Trenutno se sprovodi intenzivan skrining i istraživanje uticaja različitih supstanci koje potiču iz prirodnih izvora i kao rezultat hemijske sinteze na regulaciju QS i ekspresiju gena vezanih za QS. Pronađena je interakcija sa QS supstanci srodnih polifenolima; jer polifenoli su široko rasprostranjeni u biljnom carstvu, te se sugerira da bi mogli biti važni u zaštiti biljaka od patogenih bakterija. Pokazalo se da brojne supstance koje proizvode biljke mogu da stupe u interakciju sa QS sistemima; priroda ovih supstanci se proučava.

Trenutno postoje svi razlozi za vjerovanje da lijekovi koji inhibiraju QS mogu biti obećavajuća alternativa tradicionalnim antibakterijskim terapijskim lijekovima za medicinu, poljoprivredu i prehrambenu tehnologiju. Ili će, barem, moći pojačati antimikrobni učinak upotrijebljenih lijekova. Rad u ovom pravcu se aktivno provodi u mnogim laboratorijama i kompanijama širom svijeta.

2.1. opšte karakteristike i mehanizam za otkrivanje kvoruma

Sistem međućelijske komunikacije u mikroorganizmima naziva se sistem quorum sensing (QS). Danas se QS sistem definiše kao sistem koordinisane ekspresije gena u populaciji, u zavisnosti od njenog indeksa gustine, koristeći male signalne molekule. Kao što je gore navedeno, ovaj mehanizam je prvi put opisao Nilson 1970. u morskoj bakteriji. Vibrio fisheri kao sistem regulacije bioluminiscencije. U početku se pretpostavljalo da je ovaj regulatorni mehanizam karakterističan za samo mali broj blisko povezanih vrsta roda Vibrio, međutim, daljnje studije su pokazale široku rasprostranjenost ovog regulatornog mehanizma u svijetu mikroorganizama. Utvrđeno je da uz pomoć QS sistema mikroorganizmi mogu regulisati mnoge životne procese, posebno patogenost, sekundarni metabolizam, stvaranje biofilma i još mnogo toga. Pokazalo se da se QS sistem nalazi ne samo kod bakterija, već i kod nekih nižih eukariota, kao što su gljive nalik kvascu iz rodova Candida I Cryptococcus. Štaviše, pokazalo se da uz pomoć ovog sistema mikroorganizmi mogu komunicirati ne samo sa svojom vrstom, već i za obavljanje međuregionalne komunikacije, uključujući i više eukariote.

Općenito, funkcionisanje QS sistema zasniva se na nizu ključnih principa (slika 1):

1. 
   Upotreba malih signalnih molekula - u sistemu QS, prijenos signala iz jedne ćelije u drugu vrši se pomoću signalnih molekula različite kemijske prirode.
2. 
   Prisustvo specifičnih receptora – signalnih molekula ne utiče direktno na ekspresiju ciljnih gena. Aktivacija ciljnih gena nastaje tek nakon vezivanja signalnih molekula za odgovarajuće receptore.
3. 
   Uticaj gustine ćelijske populacije – QS sistem se pokreće tek nakon dostizanja određene vrednosti gustine ćelijske populacije, koja je u korelaciji sa koncentracijom signalnih molekula u spoljašnjoj sredini.
4. 
   Samoodržavanje funkcionisanja – kontrola sinteze novih signalnih molekula i receptora vrši se na isti način kao i kod ciljnih gena u odsustvu aktivacije sistema represije.
5. 
   Prisustvo mehanizama selektivne negativne regulacije - u ćelijama mikroorganizama postoje i zavisni i nezavisni od QS geni negativne regulacije, čiji su proizvodi u stanju da selektivno isključuju čitave karike QS sistema ili čitav sistem u celini .

Rice. 1. Opća shema funkcionisanja kvorum sensing sistema.

Ovi principi su zajednički za gotovo sve tipove QS sistema, bez obzira na njihovu specifičnu strukturnu organizaciju. Početak QS sistema obično se vremenski poklapa sa ranom fazom eksponencijalnog rasta, koju karakteriše brz porast gustine ćelijske populacije. Ekspresija ciljnih gena, naprotiv, obično počinje izlaskom stanične populacije u stacionarnu fazu i obično je složena, odnosno uključuje početak biosinteze gotovo svih QS-reguliranih proizvoda u kratkom periodu od vrijeme. Dakle, rane faze QS sistema su da. obezbeđivanje biosinteze signalnih molekula i njihovih receptora, do određene tačke, što se poklapa sa akumulacijom maksimalne koncentracije signalnih molekula u međućelijskom prostoru, nakon čega rad QS sistema prelazi u samoodrživo stanje.

Mehanizmi koji stoje u osnovi ranog aktiviranja QS sistema još nisu u potpunosti razjašnjeni. Uprkos činjenici da je otkriven veliki broj različitih regulatora, kojima se pripisuje određena uloga u ranom aktiviranju sistema, mnoga pitanja ostaju nerazjašnjena. Prije svega, nije jasno kako je regulirano primarno nakupljanje signalnih molekula i njihovih receptora. Postoji hipoteza da je određeni broj signalnih molekula i receptora za njih stalno prisutan u ćelijama, a njihova primarna akumulacija se odvija po istom samoodrživom mehanizmu, dok se dio unutarćelijskog pula ovih spojeva troši na sintezu signalnih molekula i receptora. Ostatak se izlučuje iz ćelija i, kada dostigne graničnu koncentraciju, ponovo se apsorbuje i pokreće ekspresiju ciljnih gena. Međutim, na osnovu karakteristika funkcionisanja nekih tipova QS sistema, to se čini malo verovatnim. James P. Pearson, naprotiv, smatra da se početno lansiranje QS-a vrši uz pomoć nespecifičnih regulatora transkripcije kao npr. MvaT I Vfr(V irulencija f glumci r regulator) Pseudomonas aeruginosa, a sistem mnogo kasnije prelazi u samoodrživo stanje.

2.2. Reakcije čula kvoruma u gram-pozitivnim mikroorganizmima

Klasični sistem zavisan od kvoruma peptida može se smatrati sistemom odgovornim za konjugativni prijenos plazmida u Enterococcus faecalis i srodne bakterijske vrste. Ovaj sistem stimuliše distribuciju u mikrobnoj populaciji osobina važnih za interakciju mikroorganizma i životinje domaćina, kao i za eliminaciju konkurencije. Plazmid pPDl nošen peptidnim kvorumom zavisnim sistemom odgovoran je za sintezu hemolizina, plazmid pCDl je odgovoran za stvaranje bakteriocina, plazmid pCFlO je odgovoran za rezistenciju E.faecalis na tetraciklin. Svaki heksa- ili okta-peptid indukuje adheziju bakterijskih ćelija i njihovu konjugaciju sa transferom specifičnog plazmida sa donora na primaoca. Na primjer, cPDl oktapeptid stimulira konjugativni prijenos pPDl plazmida. Plazmid kodira receptor koji se nalazi na represorskom proteinu odgovarajućeg operona. Interakcija oligopeptida sa receptorom uzrokuje disocijaciju represora od DNK, čime se pokreće sinteza odgovarajućeg proizvoda. PPDl plazmid također uključuje traC gen, čiji je proizvod protein koji olakšava prodiranje peptida kroz ćelijski zid. Oligopeptidne signale intenzivno sintetiziraju ćelije koje ne nose odgovarajuće plazmide (primaoce), dok je sinteza takvih signala potisnuta u donorskim ćelijama, štoviše, plazmid kodira inhibitorni peptid.

Produkt plazmida pPDl je iPDl peptid, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Još jedan proces ovisan o kvorumu pronađen u E.faecalis, je proizvodnja dva faktora virulencije: želatinaze (GelE) i serin proteaze (SprE).

Primer upotrebe peptidnog signala za međućelijske interakcije je kvorum senzorski sistem, koji kontroliše sintezu egzotoksina u kasnoj logaritamskoj fazi rasta u Staphylococcus aureus. U ovom sistemu, AgrD protein se sintetiše kao prekursor koji se sastoji od 46 aminokiselina, koji se tokom izvoza AgrB proteinom pretvaraju u zreli AIP (autoinducirajući peptid) koji se sastoji od 8 aminokiselina. AIP prepoznaje dvokomponentna senzorska kinaza AgrC, koja prenosi signal u ćeliju tokom fosforilacije regulatora odgovora, AgrA. AgrA~P aktivira transkripciju ciljnih gena, stimuliše transkripciju agrB, D, C, A operona (pozitivna autoregulaciona petlja), a takođe „zabranjuje“ transkripciju gena koji kodiraju druge egzotoksine. Na osnovu razlika u AIP-u i njegovom receptoru, sojevi S. aureus može se dodijeliti u četiri ili više grupa. Oligopeptidi koje sintetiše jedna od grupa izazivaju patogenost u ovoj grupi i specifično potiskuju Agr-virulentne sisteme u drugim grupama.

Pojava kompetencije u kasnoj logaritamskoj fazi rasta zavisi od gustine naseljenosti. Streptococcus pneumoniae. comC gen kodira prekursor koji se sastoji od 41 aminokiselinskog ostatka. Potonji se pretvara u zreli peptid koji se sastoji od 17 aminokiselinskih ostataka u procesu interakcije sa sistemom za izvoz peptida (ABC sistem), koji je formiran od proizvoda comAB gena. Peptid dolazi u kontakt sa svojim receptorom na površini ćelije, histidin kinazom, proizvodom comD gena. Aktivirana histidin kinaza fosforilira proizvod comE gena. Kako se ćelije akumuliraju, broj peptidnih signala se povećava i dostiže kritični nivo u mediju. Shodno tome, povećava se i količina fosforiliranog comE proteina, koji se, počevši od određene koncentracije, vezuje za promotor comCDE operona, stimulirajući njegov rad (pozitivna autoregulaciona petlja), aktivira promotor comAB operona (sistem za izvoz proteina iz ćelije) , aktivira comX operon, koji uključuje cijeli lanac kasnih kompetentnih gena; odgovoran za vezivanje i apsorpciju transformirajuće DNK i svih ostalih, kasnih faza transformacije.

Pored gore navedenih primjera reakcija kvoruma kod gram-pozitivnih bakterija, treba napomenuti da, osim oligopeptida, gram-pozitivne bakterije također koriste tvari različite kemijske prirode kao signalne molekule. Dakle, predstavnici reda Actinomycetales Uz signalne molekule peptida pronađene su tvari niskomolekularne prirode, od kojih većina sadrži laktonsku grupu.

U streptomicetama, butirolaktoni i njihovi odgovarajući proteinski receptori uključeni su u kvorum-sensing sisteme, koji zajednički regulišu morfološki razvoj i proizvodnju antibiotika kod svojih proizvođača. Najdobro proučavan regulator aktinomiceta je A-faktor, koji je 2-izo-kapriloil-3-hidroksimetil-y-butirolakton.

Utjecaj A-faktora na morfološko diferencijaciju i stvaranje antibiotika podliježe općoj shemi rada regulatora streptomiceta koji sadrže laktonsku grupu. U ranim fazama rasta, kada je koncentracija A-faktora niska, receptor A-faktora (AgrA) se vezuje za i potiskuje ekspresiju hipotetičkog zajedničkog aktivatora biosinteze i sporulacije streptomicina. Izolacija AgrA iz ćelijskog lizata S. griseus Pokazalo se da je IFO 13350 protein od 276 aminokiselina s molekulskom težinom od 29,1 kDa.

Kako se gustina kulture povećava, koncentracija faktora A dostiže kritični nivo na kojem veže AgrA, uzrokujući odvajanje potonjeg od DNK i na taj način uključuje transkripciju ključnog gena za adpA koji kodira AdpA (protein od 405 aminokiselina koji sadrži vezujući mesto u centralnom regionu). sa DNK, slično kao regulatori transkripcije iz porodice proteina AraC/XylS). AdpA je, pak, pozitivan regulator otkrivenog citoplazmatskog aktivatora klastera gena biosinteze streptomicina i aktivatora procesa sporulacije. Citoplazmatski aktivator, vezujući se za DNK u regionu promotora gena za specifičnu regulaciju strR strR klastera biosinteze streptomicina, indukuje transkripciju ovog gena, gena za otpornost na sopstveni antibiotik, aphD, koji se nalazi iza njega, gen adsA, koji kodira ekstracitoplazmatski a-faktor RNA polimeraze, neophodan za formiranje zračnog micelija, kao i gen sgmA koji kodira protein peptidaze, koji zajedno s drugim hidrolitičkim enzimima učestvuje u razgradnji proteini supstrata micelija kao rezultat formiranja zračnog micelija. Regulatorni proizvod strR gena određuje početak transkripcije gena strukturne biosinteze kao dijela klastera StrR zavisnih promotora. Početak ekspresije iz promotora strR gena pod uticajem citoplazmatskog aktivatora takođe obezbeđuje proizvodnju aphD genskog produkta, aminoglikozid fosfotransferaze, a time i stvaranje osnovnog nivoa rezistencije soja na sopstveni antibiotik.

Pokazano je da kod različitih vrsta streptomiceta postoji homologija između strukturnih elemenata regulatora. Nukleotidne sekvence homologne agrA genu u S. griseus, nalaze se i kod drugih streptomiceta. Na primjer, kod S.coelicolor A3 (2), pronađena su dva gena srA i srB, koji kodiraju AgrA-slične proteine ​​CrA i CrB, koji su 90,7% slični jedni drugima i 35% AgrA.