Recombinări genetice: transducție, transformare, conjugare, transpunere. Conceptul de inginerie genetică

Ne-am familiarizat cu procesul de duplicare a ADN-ului, când o altă catenă este construită pe o catenă, ca pe o matrice. Cu toate acestea, în natură există procese asociate cu modificări ale structurii ADN-ului, dar aceste modificări merg în alte direcții.

Transformare- introducerea informaţiei genetice în celulă cu ajutorul acidului dezoxiribonucleic (ADN) izolat. Transformarea duce la apariția în celula transformată (transformant) și descendenții acesteia a unor noi trăsături caracteristice obiectului - sursa ADN-ului. Fenomenul a fost descoperit în 1928 de omul de știință englez F. Griffith, care a observat restabilirea ereditară a sintezei polizaharidelor capsulare la pneumococi când șoarecii au fost infectați cu un amestec de bacterii încapsulate ucise termic și celule fără capsulă. Organismul de șoarece din aceste experimente a jucat rolul unui fel de detector, deoarece achiziția unei polizaharide capsulare a informat celulele lipsite de capsulă capacitatea de a provoca un proces infecțios care este fatal pentru animal. În experimentele ulterioare, s-a constatat că transformarea are loc și atunci când, în loc de celule ucise, un extract din bacterii încapsulate distruse a fost adăugat pneumococilor fără capsulă. În 1944, O. Avery și colaboratorii (SUA) au stabilit că moleculele de ADN sunt factorul care asigură transformarea. Această lucrare este primul studiu care demonstrează rolul ADN-ului ca purtător de informații ereditare.

Pe lângă pneumococi, transformarea a fost descoperită și studiată în mai multe alte bacterii.

Transformarea bacteriilor este considerată un proces complex care include următoarele etape:

Fixarea moleculelor de ADN de către celula primitoare;

Penetrarea ADN-ului în celulă;

Încorporarea fragmentelor de ADN transformatoare în cromozomul celulei gazdă;

Formarea unor variante transformate „pure”.

Fixarea ADN-ului are loc pe zone speciale ale suprafeței celulare (receptori), al căror număr este limitat. ADN-ul legat de receptor rămâne sensibil la acțiunea enzimei dezoxiribonuclează adăugată în mediu, ceea ce determină descompunerea acestuia. Cu toate acestea, după un timp foarte scurt (în termen de 1 minut) după fixare, o parte a ADN-ului intră în celulă. Celulele bacteriene ale aceleiași tulpini diferă brusc în ceea ce privește permeabilitatea ADN-ului. Celulele unei populații bacteriene date care sunt capabile să încorporeze ADN străin sunt numite competente . Numărul de celule competente din populație este nesemnificativ și depinde de caracteristicile genetice ale bacteriilor și de faza de creștere a culturii bacteriene. Dezvoltarea competenței este asociată cu sinteza unei proteine ​​speciale care asigură pătrunderea ADN-ului în celulă.

Dimensiunea medie a fragmentelor de ADN care pătrund în celulă este de 5×106 daltoni. Deoarece un număr de astfel de fragmente pot intra simultan într-o celulă competentă, cantitatea totală de ADN absorbit poate fi aproximativ egală cu dimensiunea cromozomului celulei gazdă. După ce ADN-ul dublu catenar pătrunde în celulă, o catenă se descompune în mono- și oligonucleotide, a doua este integrată în cromozomul celulei gazdă prin rupturi și reuniuni. Replicarea ulterioară a unei astfel de structuri hibride conduce la izolarea clonelor „pure” de transformanți, în urma cărora este fixată trăsătura codificată de ADN-ul inclus.

Aplicarea transformării a făcut posibilă realizarea analiza genetică bacterii în care nu au fost descrise alte forme de schimb genetic (conjugare, transducție). În plus, transformarea este o metodă convenabilă pentru elucidarea efectelor asupra activității biologice a ADN-ului modificărilor fizice sau chimice ale structurii sale. Dezvoltarea metodei coli a făcut posibilă utilizarea pentru transformare nu numai a fragmentelor de cromozom bacterian, ci și a ADN-ului plasmidelor bacteriene și bacteriofagelor. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru a introduce ADN hibrid într-o celulă în cercetarea de inginerie genetică.

transducție(din latină transductio - mișcare) - transferul de material genetic de la o celulă la alta cu ajutorul unui virus, ceea ce duce la o modificare a proprietăților ereditare ale celulelor primitoare. Fenomenul de transducție a fost descoperit de oamenii de știință americani D. Lederberg și N. Zinder în 1952. Virușii bacterieni speciali - fagii temperați în procesul de reproducere vegetativă sunt capabili să captureze și să transfere accidental către alte celule orice segmente de ADN lizate, adică distruse de ei, bacterii ( general , sau nespecifice , transducție). Lungimea segmentului de ADN transferat (transdus) este determinată de dimensiunea învelișului proteic al particulei de fag și de obicei nu depășește 1-2% din genomul bacterian. Un segment transferat poate conține mai multe gene. Deoarece probabilitatea unei astfel de transducție legată depinde de distanța dintre genele din molecula de ADN care formează cromozomul bacterian, fenomenul de transducție este utilizat pe scară largă în compilarea hărților genetice ale cromozomilor bacterieni. Materialul genetic al fagului este absent în astfel de particule transductoare; prin urmare, prin introducerea ADN-ului în celulă, nu îndeplinesc toate celelalte funcții ale fagului: nu se înmulțesc, nu lizogenizează celula și nu o dotează cu imunitate față de fag. Fragmentul introdus poate exista în celulă ca element genetic suplimentar cu activitate funcțională. Deoarece un astfel de fragment nu este capabil să se reproducă, la fiecare diviziune celulară este transferat doar la una dintre celulele fiice. Cu excepția acestei celule, proprietățile restului descendenților rămân neschimbate ( avortiv transducție). Ulterior, fragmentul poate fi fie distrus, fie încorporat în cromozomul bacterian, înlocuind regiunea ADN omoloagă din acesta. În acest din urmă caz, noile trăsături dobândite de celula transductantă vor fi caracteristice tuturor descendenților acestei celule ( complet transducție).

Există un grup de bacteriofagi capabili să transducă doar anumite gene situate în apropierea locului de includere a genomului fagului în cromozomul bacterian în timpul lizogenizării ( limitat , sau specific , transducție). Astfel de particule de fagi transductoare, formate ca urmare a unei încălcări accidentale a preciziei procesului de ieșire a profagului din cromozomul bacterian, conțin o moleculă de ADN constând din restul genomului fagului și un fragment al genomului bacterian. În cele mai multe cazuri, nu pot reproduce sau lizogeneza bacteriile singure din cauza pierderii unei părți a genomului fagului (până la 30%). Materialul genetic al particulelor transductoare poate fi stocat în celulă într-o stare autonomă sau încorporat în ADN-ul bacterian ca profet. Cu toate acestea, în ambele cazuri, o parte din urmași restabilește proprietățile originale din cauza pierderii profagei. Transducția stabilă se realizează numai dacă fragmentul bacterian al profagului este inclus în genomul bacterian ca rezultat al schimbului cu o regiune omoloagă a cromozomului.

epizomi(din epi... și greacă sóma - corp) - factori genetici capabili să fie într-o celulă fie în stare autonomă (în citoplasmă), fie în stare integrată (inclusă în cromozom); sunt molecule de ADN. Epizomii includ genomul fagului lambda temperat, factorul sexual F, unii factori R care fac bacteriile rezistente la anumite medicamente, substanțe și altele. Epizomii nu sunt componente esențiale ale celulelor și pot trece de la o stare la alta, care depinde de tipul de celulă. De exemplu, genomul fagului lambda temperat din celulele Escherichia coli poate fi într-o stare integrată sau autonomă, în timp ce în celulele agentului patogen al febrei tifoide poate fi doar într-o stare autonomă. Când se află într-o stare autonomă, majoritatea epizomilor se comportă ca plasmidele tipice. O serie de autori văd epizomii ca pe o legătură de tranziție între structurile care determină ereditatea cromozomială și non-cromozomială.

Diagnosticul ADN

Corpul uman este un habitat pentru sute de specii de bacterii și viruși. Din punct de vedere biologic, corpul uman este un întreg sistem de organisme simbionte coexistente. Nu toți simbioții sunt patogeni. Fără unele tipuri de bacterii, o persoană pur și simplu nu poate exista, pierderea sau scăderea numărului acestora este cauza dezvoltării unui număr de boală gravă. Descifrarea genomilor multor agenți patogeni cu identificarea tuturor proteinelor va ajuta la dezvoltarea metodelor de prevenire și tratare a bolilor infecțioase.

Pentru dezvoltare proces infecțios mare importanță are statutul genetic al gazdei în sine. De exemplu, unii indivizi sunt purtători ai virusului imunodeficienței, dar nu fac SIDA. Acești indivizi au o mutație în gena care codifică proteina de suprafață responsabilă de intrarea virusului în celulele limfoide. Densitatea proteinei de la suprafața celulelor este redusă, virusul este reținut, dar nu intră în interior. Frecvența homozigoților pentru această mutație printre europeni este de aproximativ 1%, aceștia au o rezistență pronunțată la infecțiile cu HIV. Purtătorii de mutații heterozigoți se dovedesc, de asemenea, a fi mai rezistenți; în populația rusă, frecvența lor ajunge la 13%.

Schimbări de combinație.

Ele apar ca rezultat al transformării și conjugării. Transformarea este procesul de transfer a unei secțiuni de material genetic ADN care conține o pereche de nucleotide de la o celulă donor la o celulă receptor.

Există 5 etape în procesul de transformare:

1) Adsorbția ADN-ului transformator pe suprafața unei celule microbiene;

2) Penetrarea ADN-ului în celula primitoare;

3) Împerecherea ADN-ului introdus cu structurile cromozomiale ale celulei;

4) Încorporarea unei porțiuni din ADN-ul celulei donatoare în structurile cromozomiale ale celulei primitoare;

5) Schimbare ulterioară a nucleotidei în timpul diviziunilor ulterioare. Temperatura optimă de transformare este 29-32С.

Transducția este o modificare în care materialul genetic al unei celule donatoare este transferat către o celulă primitoare de către un fag transductor (temperat), adică. fag care nu provoacă distrugerea acestuia.

Există trei tipuri de transducție:

1) General (nespecific), poate exista un transfer de diferite sau mai multe semne în același timp.

2) Specific, caracterizat prin transferul doar a unei anumite caracteristici.

3) Abortiv, regiunea ADN a celulei donatoare, transferată de fag în celula primitoare, nu este inclusă în genomul acesteia.

Conjugarea este o formă a procesului sexual în care celulele microbiene masculine și feminine sunt conectate și substanța nucleară este schimbată între ele.

În acest caz, materialul genetic al celulei donatoare trece în celula primitoare. După recombinare și diviziune celulară se formează forme cu semne de celule conjugate.

Astfel, toate cele trei forme de variabilitate combinativă (transformare, transducție, conjugare) sunt diferite ca formă, dar identice în esență. În timpul transformării, o porțiune din ADN-ul celulei donatoare intră în celula primitoare, în timpul transducției acest rol este îndeplinit de fag, iar în timpul conjugării, transferul informațiilor genetice se realizează prin puntea citoplasmatică (pili).

Rickettsia

Microbii Gram negativi. Forma este bastoane scurte sau coci. Rickettsiae au un perete celular care este similar cu cel al bacteriilor Gram-negative.

Sunt clasificate drept bacterii adevărate. procariote.

Nitrificare.

Produșii de degradare ai proteinelor și descompunerea sărurilor de uree, amoniac și amoniu pot fi absorbiți direct de plante, dar de obicei sunt transformați în nitrați de acid azotic.

În prima fază de nitrificare, amoniacul este oxidat la acid azotic conform schemei

DG = -662kJ/mol.

Procesul de nitrificare se desfășoară în mai multe etape, cu formarea unui număr de produse intermediare: hidroxilamină, nitroxid etc.

În a doua fază, acidul azot este oxidat în acid azotic:

DG= -201kJ/mol.

Prima și a doua fază ale unui singur proces de nitrificare sunt cauzate de diferiți agenți patogeni. S.N. Vinogradsky le-a grupat în trei genuri:

1) Nitrosomonas. Sunt în formă de tijă, gram-negative, mobile, echipate cu un flagel, nu formează spori. Sunt distribuite pe scară largă în sol și diferă unele de altele ca formă și dimensiune.

2) Nitrozocystis. Capabil să formeze zoogleys (forme cocice de microbi care înconjoară capsula)

3) Nitrosospira. Ele sunt împărțite în două tipuri. Bacteriile ambelor specii au o formă regulată de spirală. Alături de fire răsucite în spirală, bețe scurte și coci se găsesc în culturile vechi.

Recent, au fost identificate încă două genuri de microbi care provoacă prima fază de nitrificare.

Bacteriile nitrificatoare au o atitudine negativă față de substanțele organice. Sensibilitatea puternică a microbilor nitrificatori la substanțele organice se remarcă în soluții; acest lucru nu se observă în sol, deoarece nu conține niciodată substanțe solubile în apă în cantități semnificative.

Procesele de oxidare a amoniacului sunt afectate nu numai de microbi, ci și de enzimele acestora. Pe lângă materia organică, nitrificarea este influențată de concentrația de amoniac. Efectul său asupra culturii se manifestă brusc în mediile lichide. În sol, amoniacul este în stare adsorbită și nu poate avea un efect deprimant. Prin urmare, nitrobacterul oxidează imediat acidul azotat în acid azotic.

Prezența oxigenului are un efect pozitiv asupra procesului de nitrificare. În solurile cultivate, procesul de nitrificare decurge mai intens.

Recombinarea este un set de procese asociate cu înlocuirea unui situs al acidului nucleic original cu un situs omolog (similar).

În acest caz, gradul de omologie poate fi diferit: de la identitatea completă a secvențelor de nucleotide originale și noi până la discrepanțe vizibile care conduc la o schimbare a fenotipului. Ca rezultat al recombinării, se formează noi combinații de alele, de exemplu: AB + ab → Ab + aB.

La procariote, există trei moduri de a încorpora ADN-ul străin în genom: transformare, conjugare și transducție.

Transformare

Transformarea este transferul de ADN pur de la o celulă la alta. Transformarea a fost descoperită de bacteriologul F. Griffiths în 1928 în experimente cu pneumococi. La pneumococi se cunosc două tipuri de tulpini: formele S și R.

Forma S se caracterizează prin prezența unei capsule polizaharidice, datorită căreia, în timpul cultivării artificiale, formează colonii netede, strălucitoare; această formă este patogenă pentru șoareci. Forma R nu are capsulă, în timpul cultivării artificiale, formează colonii aspre; această formă este nepatogenă pentru șoareci. Dar dacă șoarecii sunt injectați cu celule S ucise și celule R vii în același timp, șoarecii mor. Prin urmare, proprietățile genetice ale unei tulpini influențează proprietățile genetice ale altei tulpini.

În 1944, O. Avery, K. McLeod și M. McCarthy au demonstrat că modificările proprietăților ereditare ale celulelor sunt asociate cu transferul de ADN.

Capacitatea unei celule de a se transforma este posibilă în starea sa specială, care se numește competență. Celulele competente își schimbă compoziția perete celularşi plasmalema: peretele devine poros, plasmalema formează numeroase invaginări, iar pe suprafaţa exterioară apar antigene speciale - factori de competenţă (în special, proteine ​​specifice cu greutate moleculară mică).

În condiții naturale, ADN-ul pur extracelular se formează în timpul morții (lizei) procariotelor.

De regulă, transformarea are loc în cadrul unei specii de procariote, dar în prezența genelor omoloage se observă și transformarea interspecifică.

Procesul de transformare include următoarele etape:

1. Atașarea ADN-ului dublu catenar transformat la receptorii de pe suprafața celulei primitoare.

2. Transformarea ADN-ului dublu catenar în monocatenar.

3. Penetrarea ADN-ului monocatenar în celulă.

4. Integrarea transformării ADN-ului în cromozomul receptorului și recombinarea materialului genetic.

Lungimea ADN-ului de transformare ar trebui să fie de la 500 la 200 mii bp. Energia eliberată în timpul degradării uneia dintre catenele de ADN este utilizată pentru a transporta activ catena rămasă în celulă.

Primele trei etape de transformare nu depind de compoziția nucleotidică a ADN-ului. Cu toate acestea, procesul de integrare a ADN-ului care se transformă în cromozomul receptorului este mai probabil dacă acest ADN este foarte omolog cu ADN-ul receptorului.

Procesul de transformare este prezentat în diagramă. Fiecare segment de linie corespunde unei catene de ADN. ADN-ul care se transformă este afișat cu negru, iar ADN-ul celulei primitoare este afișat cu gri.

În prima etapă, ADN-ul transformator se atașează de situsurile receptorului de pe suprafața celulei primitoare.

În a doua etapă, ADN-ul dublu catenar de pe suprafața celulei este transformat în ADN monocatenar datorită clivajului uneia dintre catenele de către nucleazele bacteriene.

În a treia etapă, catena de ADN rămasă este transportată prin membrană în citoplasmă. În acest caz, se utilizează energia eliberată în timpul degradării lanțului complementar.

În timpul replicării unui cromozom bacterian, catena de ADN care se transformă este atașată la o regiune de ADN omoloagă (parțial complementară) a celulei primitoare. În acest caz, din cauza lipsei de complementaritate completă, se formează un heteroduplex („heterozigot molecular”) - o secțiune de ADN dublu catenar pe care bazele azotate nu sunt conectate prin legături de hidrogen în toate perechile de nucleotide. Restul ADN-ului se replic normal.

După sfârșitul replicării ADN-ului, celula primitoare se divide pentru a forma două celule: o celulă parțial transformată cu un cromozom care include o regiune ADN heteroduplex și o celulă netransformată. În timpul replicării ADN-ului într-o celulă parțial transformată, lanțurile complementare sunt completate pe ambele catene de ADN. Un lanț reține secvențele de nucleotide originale, în timp ce celălalt devine complet transformat. După divizarea unei celule parțial transformate, se formează o celulă netransformată și o celulă complet transformată, în care secvența de nucleotide inițială este înlocuită cu secvența de nucleotide a ADN-ului transformator.

Astfel, în timpul transformării, genele primitoare sunt înlocuite cu secvențe de nucleotide omoloage. Cu cât gradul de omologie este mai mare, cu atât transformarea este mai reușită.

Frecvența transformării la procariote depinde de proprietățile ADN-ului transformator, de concentrația acestuia, de starea celulei primitoare și de tipul bacteriilor. Frecvența maximă a celulelor transformate nu depășește 1 la 100 de celule.

Transformarea este cunoscută și pentru eucariote. Cu toate acestea, nu există locuri de receptor pe suprafața celulelor eucariote, iar ADN-ul care se transformă este introdus artificial în celule. De exemplu, ADN-ul este injectat în ouăle de animale prin microinjecție directă și în ouăle de plante prin microinjectare în tubul de polen. Sunt utilizate pe scară largă metode de biobalistică (biolistică), care permit introducerea oricăror fragmente de ADN în culturile de țesuturi vegetale.

Conjugare

Conjugarea la procariote este contactul direct a două celule de calitate diferită, însoțită de un transfer cel puțin parțial de material genetic de la celula donatoare la celula primitoare. (Procesul de conjugare a fost descoperit în 1946 de J. Lederberg și E. Tatum).

La E. coli, celula donatoare („mascul”) are o formă alungită, celula primitoare („feminină”) este izodiametrică. Celula donatoare formează vilozități genitale (pili), care o atrag către celula primitoare și formează canale citoplasmatice. Aceste canale transportă ADN-ul de la celula donatoare la celula primitoare. Există trei tipuri de celule donatoare: F + (ef-plus), Hfr (h-ef-a) și F ′ (ef-prim).

Donorii F+ conțin în citoplasmă factorul sexual – o plasmidă F specifică.

Plasmida F este un replicon autonom de aproximativ 100 kb lungime. Peste 20 de gene au fost studiate în plasmida F. Aproximativ jumătate dintre ei formează operonul tra gigant (aproximativ 30 kb lungime); produsele acestui operon controlează formarea unui contact între donor și primitor și transferul propriu-zis de ADN. Alte gene reglează activitatea tra-operonului.

Celula primitoare nu conține o plasmidă F și este desemnată ca o celulă F.

Când se formează o punte citoplasmatică, unul dintre lanțurile de plasmide F este tăiat într-un anumit punct (punctul O), iar replicarea ADN-ului începe pe lanțul complementar conform principiului „inelului de rulare”. O copie a lanțului complementar trece prin puntea citoplasmatică în citoplasma celulei primitoare, iar lanțul lipsă este completat pe acesta. După sfârșitul replicării, ADN-ul plasmid dublu catenar se închide într-un inel, iar celula F - se transformă într-o celulă F +. Timpul total de transfer al copiei plasmidei F în celula primitoare este de aproximativ 5 minute.

Cu toate acestea, atunci când F + × F – este încrucișat, numai genele conținute în F– plasmidă; genele menajere situate pe cromozomul bacterian nu sunt transferate celulei primitoare.

În același timp, plasmida F se poate integra în cromozomul bacterian, adică poate intra într-o stare integrată. Există aproximativ 20 de situsuri de integrare a plasmidei F în cromozomul bacterian. Apoi, când o copie a unuia dintre lanțurile de plasmide F este transferată în celula primitoare, o copie a unuia dintre lanțurile cromozomului bacterian este purtată împreună cu aceasta. Celulele cu o plasmidă F integrată se numesc donatori Hfr (din engleză). frecventa inalta recombinare"). În funcție de condiții, este posibil un transfer complet sau parțial al unei copii a cromozomului bacterian donor Hfr în citoplasma primitorului. Ca rezultat, se formează o celulă cu un cromozom bacterian dublu catenar inițial și o moleculă de ADN monocatenară omoloagă completă sau incompletă. O astfel de celulă se numește merozigot („zigot parțial”). Mai mult, în timpul replicării ADN-ului are loc recombinarea. Acest proces nu este fundamental diferit de recombinarea în timpul transformării.

Transferul copiei ADN începe aproximativ de la mijlocul ADN-ului plasmidei F (din punctul O, în care una dintre catenele de ADN este crestat, și începe replicarea ADN-ului plasmidei F). Astfel, jumătate din ADN-ul plasmidei F intră în celula primitoare la începutul conjugării, iar cealaltă jumătate numai după transferul complet al unei copii a ADN-ului cromozomial. Este nevoie de mai mult de 100 de minute pentru a finaliza acest proces la t = 37 0 С. Cu toate acestea, în condiții naturale, conjugarea este întreruptă mult mai devreme; doar o parte a copiei cromozomului donor și doar prima jumătate a ADN-ului plasmidei F intră în celula primitoare. Astfel, celula primitoare nu preia proprietățile donatorului Hfr.

Cu toate acestea, există tulpini de bacterii în care o copie a cromozomului bacterian, împreună cu o copie a ADN-ului plasmidei F, este complet transferată. Astfel de celule sunt numite vHfr-donors (din engleză. „Frecvență de recombinare foarte mare”).

Probabilitatea de a transfera o anumită genă în celula primitoare depinde de îndepărtarea acesteia din ADN-ul plasmidei F sau, mai degrabă, din punctul O, în care începe replicarea ADN-ului plasmidei F. Cu cât timpul de conjugare este mai lung, cu atât este mai mare probabilitatea de a transfera o anumită genă. Acest lucru face posibilă realizarea unei hărți genetice a bacteriilor în câteva minute de conjugare. De exemplu, în Escherichia coli, gena thr (un operon de trei gene care controlează biosinteza treoninei) este situată în punctul zero (adică direct lângă ADN-ul plasmidei F), gena lac este transferată după 8 minute, gena recE după 30 de minute, gena argR - după 70 de minute etc.

Plasmida F poate trece de la o stare integrată la o stare autonomă prin auto-excizie din cromozomul bacterian. În acest caz, este posibilă și captarea unor părți ale ADN-ului cromozomial (până la 50% din genele cromozomiale). Plasmida F, inclusiv genele cromozomiale, se numește factor F′. Transferul de material genetic în timpul încrucișărilor F ′ × F se numește sexducție.

Pe lângă plasmida F, la procariote mai sunt cunoscuți și alte tipuri de factori sexuali (R, Ent, Hly, Col), care asigură transferul materialului genetic de la bacterie la bacterie. Pe baza plasmidelor naturale (inclusiv ADN-ul cloroplastelor și mitocondriilor), s-au obținut molecule de ADN semisintetice care asigură transferul materialului genetic de la o celulă la alta, numite vectori. Vectorii ar trebui să asigure nu numai transfer stabil de gene, ci și reglarea transcripției lor.

Plasmidele procariote se pot replica doar în celulele procariote. În același timp, este nevoie de transfer de gene de la eucariote la procariote și invers. Pentru aceasta, se folosesc plasmide navetă care conțin doi replicatori (procariote și eucariote) și care sunt capabile să se replice atât în ​​celule procariote, cât și în celule eucariote, de exemplu, plasmide Ti- și Ri capabile să se replice în celule procariote și procariote. celule vegetale, și vectori semi-sintetici bazați pe acestea. Pentru a proteja vectorii de distrugerea de către nucleaze, aceștia sunt închiși în vezicule fosfolipide - lipozomi.

transducție

Transducția este transferul de material genetic de către viruși de la o celulă donatoare la o celulă primitoare. (Fenomenul de transducție a fost descoperit în 1951 de N. Zinder (un student al lui J. Lederberg)).

În timpul transducției, ADN-ul celulei gazdă intră în virioni. Virionii infectează alte celule, iar ADN-ul celulei bacteriene originale intră în cealaltă celulă bacteriană. ADN-ul viral se integrează în cromozomul bacterian, iar ADN-ul bacterian introdus se recombină cu ADN-ul cromozomului bacterian. Ca rezultat, 50% din celule sunt transformate.

Există transducții generale (nespecifice), limitate (specifice) și abortive.

Transducția generală

În transducția totală, fragmentele de ADN bacterian de la un donor sunt încorporate aleatoriu într-o particulă de fag în curs de maturizare împreună cu sau în locul ADN-ului fag. Fragmente de ADN bacterian se formează atunci când este tăiat de o enzimă controlată de fag. O particulă de fag poate include până la 100 de gene bacteriene.

Transducție limitată

Cu transducție limitată, are loc recombinarea - ADN-ul bacterian înlocuiește o parte din ADN-ul fagului. ADN-ul recombinant conține un număr mic de gene bacteriene adiacente ADN-ului fag integrat în cromozomul bacterian.

Cu transducție totală și limitată, ADN-ul donor înlocuiește regiunile omoloage ale ADN-ului receptorului. Acest proces este similar cu transformarea.

Transducția abortivă poate fi atât nespecifică, cât și specifică. Esența sa constă în faptul că fragmentul de ADN transdus de fag nu este inclus în cromozomul receptorului, ci există ca un replicon citoplasmatic. Mai devreme sau mai târziu, acest replicon se pierde.

Fenomenul de transducție de către viruși este utilizat pe scară largă în transferul de gene la eucariote. Dacă se folosește un virus care nu poate forma o capsidă (adică există doar sub formă de ADN), atunci transducția nu este fundamental diferită de transformarea sau de transferul conjugativ al materialului genetic folosind vectori plasmidii. Sistemele vectoriale au fost create pe baza virusurilor SV40 modificate (formează până la 100 de mii de copii într-o celulă), herpes, vaccinia și virusul mozaic al conopidei.

Trebuie subliniat încă o dată că toate tipurile de recombinare descrise sunt asociate nu cu adăugarea de noi segmente de ADN, ci cu înlocuirea secvențelor de nucleotide existente. Cu cât este mai mare gradul de omologie între ADN-ul care se transformă și cel original, cu atât este mai mare probabilitatea recombinării cu succes. Cea mai ușoară cale este recombinarea enzimelor prezente în toate organismele. Este mai dificil să se introducă noi regulatori cu specificitate ridicată în genom. Prin urmare, pentru a introduce noi gene în genom, sunt utilizate metode mai complexe asociate cu modificări biochimice ale ADN-ului.

Tema 7: Moștenirea citoplasmatică . Genetica celulelor si tesuturilor somatice.

1. Moștenirea citoplasmatică. Material genetic al organitelor semi-autonome. moștenirea plastidiană. Moștenirea prin mitocondrii. Sterilitatea masculină citoplasmatică

2. Tipuri speciale de moștenire. Predeterminarea citoplasmei. Moștenirea prin infecție și endosimbioți

3. Genetica celulelor somatice. mutatii somatice. himere. Genetica cancerului.

Tema: Genetica microorganismelor 1. Conjugare, transducție, transformare. 2. Variabilitatea microorganismelor. 3. Utilizarea realizărilor în genetica bacteriană.

Aparatul ereditar al bacteriilor are o serie de caracteristici: bacteriile sunt organisme haploide, adică au 1 cromozom. În acest sens, la moștenirea trăsăturilor, nu există un fenomen de dominanță; Bacteriile au o rată mare de reproducere, în legătură cu care se înlocuiesc câteva zeci de generații de bacterii într-o perioadă scurtă de timp (zi). Acest lucru face posibilă studierea populațiilor uriașe și identificarea cu ușurință chiar și a mutațiilor rare. Aparatul ereditar al bacteriilor este reprezentat de un cromozom. Bacteriile au doar una. Cromozomul bacterian este o moleculă de ADN. Lungimea acestei molecule ajunge la 1,0 mm și, pentru a se „încadra” într-o celulă bacteriană, nu este liniară, ca la eucariote, ci este supraîncolăcită în bucle și pliată într-un inel. Acest inel la un moment dat este atașat de membrana citoplasmatică. Genele individuale sunt localizate pe cromozomul bacterian. În Escherichia coli, de exemplu, există peste 2 mii dintre ele.

2. unitati functionale genomul bacteriilor, pe lângă genele cromozomiale, sunt: ​​secvența IS; transpozoni; plasmide. Secvențe IS (inserție - inserție, secvență - secvență în engleză) - fragmente scurte de ADN. Ele nu poartă gene structurale (care codifică o anumită proteină), ci conțin doar gene responsabile de transpoziție (capacitatea secvențelor IS de a se mișca de-a lungul cromozomului și de a se integra în diferitele sale regiuni). Secvențele IS sunt aceleași pentru tipuri diferite bacterii. Transpozonii sunt molecule de ADN mai mari decât secvențele IS. Pe lângă genele responsabile de transpunere, ele conțin și o genă structurală care codifică una sau alta trăsătură. Transpozonii (elementele Tn) constau din 2000-25000 de perechi de baze, conțin un fragment de ADN care poartă gene specifice și două elemente IS terminale. Fiecare transpozon conține de obicei gene care conferă caracteristici importante bacteriei, cum ar fi rezistența multiplă la agenți antibacterieni. În general, transpozonii sunt caracterizați prin aceleași gene ca și plasmidele (gene pentru rezistența la antibiotice, producția de toxine, enzime metabolice suplimentare). Transpozonii se deplasează ușor de-a lungul cromozomului. Poziția lor afectează expresia atât a propriilor gene structurale, cât și a celor cromozomiale vecine. Transpozonii pot exista și în afara cromozomului,

Plasmidele sunt molecule circulare de ADN supraînfăşurate. Greutatea lor moleculară variază foarte mult și poate fi de sute de ori mai mare decât cea a transpozonilor. Plasmidele contin gene structurale care inzestra celulei bacteriene cu proprietati diferite, foarte importante pentru aceasta: R-plasmide - rezistenta la medicamente; Col-plasmide - capacitatea de a sintetiza colicine; F-plasmide - pentru a transfera informații genetice; Tox-plasmide - pentru a sintetiza o toxină; Plasmide de biodegradare - distrug unul sau altul substrat etc. Plasmidele pot fi integrate în cromozom (spre deosebire de secvențele IS și transpozonii, sunt construite în zone strict definite), sau pot exista autonom. În acest caz, au capacitatea de replicare autonomă și de aceea pot exista 2, 4, 8 copii ale unei astfel de plasmide într-o celulă. Multe plasmide conțin gene de transmisibilitate și sunt capabile să fie transferate de la o celulă la alta în timpul conjugării (schimb de informații genetice). Astfel de plasmide sunt numite transmisibile.

În bacterii, există 2 tipuri de variabilitate - fenotipică și genotipică. Variabilitatea fenotipică - modificare - nu afectează genotipul, ci afectează majoritatea indivizilor din populație. Modificările nu sunt moștenite și se estompează în timp, adică revin la fenotipul original după un număr mai mare (modificări pe termen lung) sau mai puțin (modificări pe termen scurt) de generații. h Variabilitatea genotipică afectează genotipul. Se bazează pe mutații și recombinări. Mutațiile bacteriilor nu sunt fundamental diferite de mutațiile din celulele eucariote. O caracteristică a mutațiilor bacteriilor este relativa ușurință a detectării lor, deoarece este posibil să se lucreze cu populații mari de bacterii. După origine, mutațiile pot fi: spontane; induse. După lungime: punctat; genetic; cromozomiale. După direcție: drept; - invers.

Recombinarea (schimbul de material genetic) la bacterii diferă de recombinarea la eucariote: bacteriile au mai multe mecanisme de recombinare; în timpul recombinărilor în bacterii, nu se formează un zigot, ca la eucariote, ci un merozigot (transportă informația genetică completă a primitorului și o parte din informația genetică a donatorului sub formă de supliment); într-o celulă recombinată bacteriană se modifică nu numai calitatea, ci și cantitatea informațiilor genetice.

Conjugarea În bacterii, o metodă de transfer de material genetic de la o celulă bacteriană la alta. În acest caz, două bacterii sunt conectate printr-o punte subțire, prin care o bucată de catenă de acid dezoxiribonucleic (ADN) trece de la o celulă (donator) la alta (recipient). Proprietățile ereditare ale primitorului se modifică în funcție de cantitatea de informații genetice conținute în bucata de ADN transferată.

Conjugare Conjugare (din latină conjugatio - conexiune), proces parasexual - transfer unidirecțional al unei părți din materialul genetic (plasmide, cromozom bacterian) cu contact direct a două celule bacteriene. Deschis în 1946 de J. Lederberg și E. Taitem. Este de mare importanță în natură, deoarece favorizează schimbul de trăsături utile în absența unui adevărat proces sexual. Dintre toate procesele de transfer orizontal al genelor, conjugarea permite transferul celei mai mari cantități de informații genetice.

Conjugarea este schimbul de informații genetice în bacterii prin transferul acesteia de la un donator la un receptor în timpul contactului lor direct. După formarea unei punți de conjugare între donor și primitor, o catenă a ADN-ului donor intră prin ea în celula primitoare. Cu cât contactul este mai lung, cu atât majoritatea ADN-ul donatorului poate fi transferat primitorului. Pe baza întreruperii conjugării la anumite intervale, este posibil să se determine ordinea genelor de pe cromozomul bacteriilor - pentru a construi hărți cromozomiale ale bacteriilor (pentru a mapa bacteriile). Celulele F+ au o funcție de donor.

Transducție Esther Lederberg a reușit să izoleze bacteriofagul lambda, un virus ADN, din Escherichia coli K 12 în 1950. Descoperirea reală a transducției este asociată cu numele lui Joshua Lederberg. În 1952, împreună cu Norton Zinder, au descoperit transducția totală. În 1953, Lederberg și colab., au arătat existența transducției abortive, iar în 1956, a transducției specifice.

Transducția este schimbul de informații genetice în bacterii prin transferul acesteia de la un donator la un receptor cu ajutorul bacteriofagelor moderati (transductori). Fagii transductori pot purta 1 sau mai multe gene (trăsături). Transducția are loc: specific - aceeași genă este întotdeauna transferată; nespecifice - se transmit diferite gene. Acest lucru se datorează localizării fagilor transductori în genomul donorului: în cazul transducției specifice, aceștia sunt întotdeauna localizați în același loc pe cromozom; la nespecifice localizarea lor este schimbătoare.

Orez. 2. Transducție 1 - bacterie - donor (B+), 2 - fag, 3 - reproducere, 4 - adsorbție, 5 - bacterie - receptor (B-), 6 - bacterie - receptor cu o nouă proprietate.

Transformarea este schimbul de informații genetice în bacterii prin introducerea unui receptor într-o celulă bacteriană produs finit ADN (preparat special sau izolat direct din celula donatoare). Cel mai adesea, transferul de informații genetice are loc atunci când receptorul este cultivat pe un mediu nutritiv care conține ADN-ul donatorului. Pentru perceperea ADN-ului donatorului în timpul transformării, celula primitoare trebuie să se afle într-o anumită măsură stare fiziologică(competență), care se realizează prin metode speciale de prelucrare a populației bacteriene sau apare spontan. În timpul transformării, sunt transmise semne unice (de obicei 1). Transformarea este cea mai obiectivă dovadă a asocierii ADN-ului sau a fragmentelor sale cu una sau alta trăsătură fenotipică, deoarece în celula primitoare este introdus un preparat ADN pur.

Orez. 3. Transformarea tulpinii capsulare a bacteriilor (1) în timpul însămânțării dă creștere (6). După fierberea acestei culturi, nu există creștere (7). Rezultatul unui astfel de experiment cu o tulpină fără capsule (4 -creștere +, 8 -creștere -) este similar. Combinarea într-un singur recipient a extractului de manioc (1) și a culturii vii a tulpinilor necapsulare (3), urmată de însămânțare, dă creșterea tulpinii capsulare (5).

Proprietățile celulelor coloniilor Forme S și R Forma S Forma R Coloniile sunt aspre, opace, cu margini neuniforme, adesea încrețite Flagelele sunt adesea absente Capsule sau stratul mucos este absent Biochimic mai puțin activ Puțin virulent sau avirulent Defect antigenic Slab sensibil la fag Suspensia se așează rapid, sediment fărâmicios, celule polimorfe Colonii transparente, cu suprafața netedă și lucioasă, rotunde, cu margini netede, convexe Speciile mobile au flageli Speciile capsulare au o capsulă sau un strat mucos clar vizibil Biochimic mai active Proprietăți virulente sunt exprimate la speciile patogene Antigen complet Sensibil la fagi Suspensie celule în ser fiziologic salin celule omogene, stabile, de dimensiuni normale

Recombinări genetice- redistribuirea materialului genetic al părinților la descendenți, ceea ce determină variabilitatea combinativă a organismelor. Ele apar cu participarea enzimelor în genele individuale.

Conjugarea - transfer de material genetic de la o celulă donatoare la o celulă primitoare prin contact apropiat. Donatorii de material genetic sunt celulele care poartă plasmida F. Celulele bacteriene lipsite de plasmida F sunt primitoare.

Prima etapă a conjugării este atașarea celulei donatoare la primitor folosind vilozități genitale. Între celule se formează o punte de conjugare, prin care plasmida F este transferată de la celula donoră la celula primitoare.

Dacă plasmida F este introdusă în cromozomul unei bacterii, o catenă de ADN se rupe cu participarea unei endonucleaze. Capătul proximal al ADN-ului pătrunde în celula primitoare prin puntea de conjugare și este imediat completat la o structură dublu catenară. Firul rămas în celula donatoare este o matrice pentru sinteza celui de-al doilea fir.

Transformare- transferul direct al materialului genetic al donatorului către celula primitoare. Transformarea are loc efectiv numai între bacterii din aceeași specie cu genotipuri diferite.

Celulele care pot accepta ADN donator sunt numite competente. Starea de competență apare în timpul creșterii celulare și coincide cu sfârșitul fazei logaritmice.

Fragmentele de ADN dublu catenar cu o greutate moleculară de cel puțin 0,5-1x106 au activitate de transformare

Procesul de transformare este format din faze:

1) adsorbția ADN-ului donor pe celula primitoare,

2) pătrunderea ADN-ului în celula primitoare cu despiralizare ulterioară,

3) conectarea unei catene de ADN cu o regiune omoloagă a cromozomului receptorului.

transducție - transfer de material genetic de la o bacterie la alta prin intermediul fagilor. Distinge:

1) transducție nespecifică– când orice genă donatoare este transferată în celula primitoare împreună cu ADN-ul fagului. Fragmentul de ADN al bacteriei donatoare transferat de către fag poate fi încorporat în regiunea ADN omoloagă a celulei primitoare prin recombinare. Fagul transducător este doar un purtător de material genetic de la o bacterie la alta, iar ADN-ul fagului în sine nu participă la formarea recombinanților,

2) transducție specifică. fagul transferă gene specifice de la bacteria donatoare la bacteria primitoare. Când fagii transductori interacționează cu celulele tulpinii primitoare, gena bacteriei donatoare, împreună cu ADN-ul fagului defect, este încorporată în cromozomul bacteriei primitoare.

3) avortiv- cand fragmentul de ADN al bacteriei donatoare adus de fag nu este inclus in cromozomul bacteriei primitoare, ci este localizat in citoplasma acesteia si poate functiona sub aceasta forma. În timpul diviziunii unei celule bacteriene recombinante, fragmentul de ADN donator adus este transferat doar la una dintre celulele fiice și dispare în timp.

Subiectul 6: Doctrina infectiei. Medicamente chimioterapeutice. Antibiotice.

Întrebări pentru auto-studiu:

1. Infecție. Condiții de apariție și modalități de transmitere a agentului patogen.

2. Forme de infecție și caracteristicile acestora.

3. Perioade de boală infecțioasă.

4. Caracterizarea toxinelor bacteriene.

5. Antibiotice: clasificare, utilizare, complicații la administrarea antibioticelor.

6. Metode de determinare a sensibilității microorganismelor la antibiotice.

7. Cele mai importante grupe de medicamente chimioterapeutice și mecanismele lor de acțiune.

Material teoretic pentru autoformare :

Data adaugarii: 2015-09-03 | Vizualizari: 888 | încălcarea drepturilor de autor