Metode genetske transfekcije u genskoj terapiji. Osnove molekularne terapije

Zdravlje

Koncept zamjene defektnih gena zdravim, koja je počela aktivno da dobija naučnu ljusku početkom devedesetih godina prošlog vekačinilo se da daje nadu najbeznadnijim pacijentima. Međutim, od prvog eksperimenta genske terapije, sprovedenog 1990. godine, optimizam među naučnicima je donekle smanjen – a sve zbog određenih neuspjeha i poteškoća u primjeni metoda genske terapije. Međutim, mogućnosti koje nudi genska terapija za liječenje Parkinsonove bolesti, cistične fibroze, razne vrste rak i mnoge druge bolesti su zaista neograničene. Zato naučnici neumorno rade pokušavaju da prevladaju sve poteškoće koje im se javljaju na putu povezane sa genskom terapijom.

Šta je genska terapija?

Dakle, šta je zapravo genska terapija? Da bismo odgovorili na ovo pitanje, potrebno je podsjetiti na to glavna funkcija gena u našem tijelu je regulacija proizvodnje proteina neophodna za normalno funkcionisanje i zdravlje svih ćelija. Ali neki genetski defekti (defekti u genima) ometaju njihovu glavnu funkciju, u jednom ili drugom stepenu sprečavajući proizvodnju proteina. Cilj genske terapije (genske terapije) je zamjenjujući defektne gene zdravim. To će pomoći da se uspostavi reprodukcija odgovarajućeg proteina, što znači da će osoba biti izliječena od određene bolesti.

S obzirom na idealan razvojni scenarij, ćelije sa prilagođene molekule deoksiribonukleinske kiseline (DNK)će se početi dijeliti, proizvodeći, zauzvrat, više kopija korigiranog gena, što će omogućiti tijelu da se riješi genetske anomalije i potpuno izliječi. Međutim, uvođenje zdravih gena u bolesne ćelije (kao i pokušaji ispravljanja odgovarajućih devijacija) je izuzetno složen proces, što je do sada retko bilo uspešno.. Zato je većina modernih istraživanja usmjerena na razvoj sigurnih i pouzdanih mehanizama za uvođenje gena u oštećene stanice.

Vrste genske terapije: ex vivo i in vivo terapija

Genska terapija, ovisno o načinu uvođenja DNK u genom pacijenta, može se provesti bilo u ćelijskoj kulturi (ex vivo) ili direktno u tijelu (in vivo). U slučaju ex vivo genske terapije, ćelije se uklanjaju iz pacijentovog tijela, genetski modificiraju, a zatim se ponovo unose u tijelo pojedinca. Ova metoda je posebno korisna u liječenju poremećaja krvi, jer se krvna zrnca vrlo lako mogu ukloniti i vratiti nazad. Međutim, u slučaju većine drugih bolesti, uklanjanje ćelija iz tijela i njihovo vraćanje u organizam nije nimalo lako. Na primjer, u slučaju srčanih bolesti uzrokovanih genetskim uzrocima efikasna mjera je takozvana in vivo genska terapija, kada se promjene gena provode direktno u tijelu pacijenta. Da bi se izvršio ovaj postupak, genetske informacije se dostavljaju direktno u ćeliju pomoću vektora - molekula nukleinske kiseline, koristi se u genetskom inženjeringu za prijenos genetskog materijala. U većini slučajeva, da bi izvršili ovaj prijenos, istraživači koriste viruse koji nisu opasni po zdravlje i život.

Metode za dostavljanje genetskih informacija u ćeliju

Brojna istraživanja pokazuju da je upotreba raznih virusa vrlo efikasno rješenje, što vam omogućava da prođete kroz imunološku odbranu tijela a zatim inficiraju ćelije, koristeći ih za širenje virusa. Za izvođenje ove procedure, genetski inženjeri su odabrali najprikladnije viruse iz grupe retrovirusa i adenovirusa. Retrovirusi donose genetske informacije u obliku ribonukleinske kiseline (RNA), molekule slične DNK koja pomaže u procesuiranju genetskih informacija pohranjenih u DNK. Čim je moguće prodrijeti duboko u takozvanu ciljnu ćeliju, kopija molekule DNK dobija se iz RNA molekula. Ovaj proces se naziva reverzna transkripcija. Kada se nova molekula DNK pričvrsti za ćeliju, sve nove kopije ćelije će sadržavati taj modificirani gen.

Adenovirusi prenose genetsku informaciju odmah u obliku DNK, koja se isporučuje u ćeliju koja se ne dijeli. Iako ovi virusi isporučuju DNK direktno u jezgro ciljne ćelije DNK se ne uklapa u genom ćelije. Stoga se modificirani gen i genetske informacije ne prenose na ćelije kćeri. Prednost genske terapije adenovirusima je u tome što je moguće uneti gene u ćelije nervnog sistema i u sluzokožu. respiratornog trakta, opet, pomoću vektora. Osim toga, postoji i treća metoda genske terapije, koja se provodi putem takozvanih adeno-asociranih virusa. Ovi virusi sadrže relativno mala količina genetskih informacija, i mnogo ih je teže eliminirati od retrovirusa i adenovirusa. Međutim, prednost adeno-povezanih virusa je u tome što ne izazivaju reakciju imunološki sistem osoba.

Poteškoće pri korištenju virusa u genskoj terapiji

Glavni problem vezan za metodu dostavljanja genetskih informacija u ćeliju putem virusa je to izuzetno je teško potpuno kontrolisati vezu gena sa ciljnom ćelijom. Ovo može biti izuzetno opasno, jer nije isključena takozvana ekspresija gena, koja zdrave ćelije može pretvoriti u ćelije raka. U ovom trenutku, ovaj problem je posebno relevantan u borbi protiv retrovirusa. Drugi problem čije rješenje još nije moguće organizirati, leži u činjenici da jedna procedura za upotrebu genske terapije, najčešće, nije dovoljna. Većinu genetskih terapija potrebno je ponavljati s vremena na vrijeme. I, treće, upotreba virusa za isporuku genetskih informacija u ćeliju je komplikovana rizikom od reakcije imunološkog sistema tijela. Ovo je takođe izuzetno ozbiljan problem, posebno u slučajevima kada kada je potrebno ponovljeno ponavljanje postupka genske terapije, kako se tijelo pacijenta postepeno prilagođava i počinje se sve efikasnije boriti protiv ubrizganih virusa.

Genska terapija: Istraživanje se nastavlja

Ako govorimo o uspjehu, onda je u ovom trenutku genetska terapija izuzetno efikasna mjera. u liječenju takozvane kombinovane imunodeficijencije, vezan za gen za X hromozom. S druge strane, vrlo je malo slučajeva uspješnog korištenja genske terapije u liječenju ove bolesti. Osim toga, sam tretman je rizičan poduhvat, jer može izazvati niz simptoma kod pacijenata koji se nalaze kod osoba koje boluju od leukemije. Osim ove bolesti, vrlo je, vrlo malo slučajeva korištenja genske terapije koja bi bila jednako efikasna, iako nedavne studije daju nadu za ranu upotrebu genske terapije za liječenje pacijenata koji boluju od artritisa, raka mozga, anemije srpastih stanica, rascjepa mrežnice i nekih drugih stanja.

Pokazalo se da je prerano govoriti o praktičnoj primjeni genske terapije u medicini. ipak, istraživači nastavljaju da traže načine da koriste gensku terapiju bezbedno i efikasno, nakon što je proveo većinu eksperimenata na živom tkivu prebačenom iz tijela u vještačko vanjsko okruženje. Među ovim eksperimentima, izuzetno su zanimljive studije u kojima naučnici pokušavaju da unesu veštački, 47. hromozom u ciljnu ćeliju. Nedavna naučna otkrića omogućila su naučnicima da bolje razumiju procese koji se dešavaju tokom uvođenja RNK molekula. To je dovelo do razvoja mehanizma za suzbijanje transkripcije gena (tzv. gen nockout), koji može biti od koristi u liječenju Hamiltonove bolesti. Naučnici također navode da su uspjeli razviti način za isporuku genetskih informacija moždanim stanicama, što se ranije nije moglo učiniti pomoću vektora, pošto je ovaj molekul bio prevelik za ovu svrhu. Drugim riječima, istraživanja se nastavljaju, što znači da čovječanstvo ima sve šanse da nauči kako se boriti protiv bolesti korištenjem metoda genske terapije.

14943 0

Utvrđivanje lokacije i sekvence gena čije mutacije uzrokuju specifične bolesti, kao i same mutacije i moderne načine njegovo testiranje omogućava dijagnosticiranje bolesti u neo- pa čak i prenatalnom periodu razvoja organizma. To omogućava ublažavanje manifestacije genetskog defekta uz pomoć liječenja lijekovima, dijetom, transfuzijom krvi itd.

Međutim, ovakav pristup ne dovodi do ispravljanja samog defekta i u pravilu se nasljedne bolesti ne mogu izliječiti. Situaciju dodatno komplikuje činjenica da mutacija jednog gena može imati različite posljedice na organizam. Ako mutacija gena uzrokuje promjene u aktivnosti enzima koji kodira, onda to može dovesti do nakupljanja toksičnog supstrata ili, obrnuto, do nedostatka spoja potrebnog za normalno funkcioniranje stanice.

Dobro poznati primjer takve bolesti je fenilketonurija. Uzrokuje ga mutacija gena za jetreni enzim fenilalanin dehidroksilazu, koji katalizira konverziju fenilalanina u tirozin. Kao rezultat, povećava se razina endogenog fenilalanina u krvi, što uzrokuje nepravilno formiranje mijelinske ovojnice oko aksona. nervne celije centralnog nervnog sistema i, kao posljedicu, tešku mentalnu retardaciju.

Ako mutacija utječe na strukturni gen proteina, onda to može dovesti do ozbiljnih poremećaja na nivou ćelija, tkiva ili organa. Primjer takve bolesti je cistična fibroza.

Brisanje gena koji kodira protein koji se zove transporter cistične fibroze dovodi do sinteze defektnog proteina (odsustvo fenilalanina 508) i poremećenog transporta jona klorida kroz ćelijske membrane. Jedan od najštetnijih efekata ovoga je da sluz koja oblaže i štiti pluća postaje nenormalno gusta. To otežava pristup ćelijama pluća i doprinosi nagomilavanju štetnih mikroorganizama. Ćelije koje oblažu disajne puteve pluća umiru i bivaju zamijenjene vlaknastim ožiljnim tkivom (otuda naziv bolesti). Kao rezultat toga, pacijent umire od respiratorne insuficijencije.

Nasljedne bolesti su složene kliničke manifestacije, a njihovo tradicionalno liječenje je uglavnom simptomatsko: za liječenje fenilketonurije propisuje se dijeta bez alanina, defektni proteini se zamjenjuju funkcionalnim. intravenozno davanje, da bi se nadoknadile izgubljene funkcije, presađuju se koštana srž ili drugi organi. Sve ove mjere su po pravilu neefikasne, skupe, dugotrajne, a samo nekoliko pacijenata doživi starost. Stoga je razvoj fundamentalno novih vrsta terapije vrlo važan.

Genska terapija

Godine 1990. u Sjedinjenim Državama, dr. W. French Andrson napravio je prvi pokušaj genske terapije za liječenje teške kombinovane imunodeficijencije (SCID) kod trogodišnje djevojčice Ashanthi da Silva. Ova bolest je uzrokovana mutacijom gena koji kodira adenozanadenilazu (ADA). Nedostatak ovog enzima doprinosi akumulaciji adenozina i deoksiadenozina u krvi, toksični efekatšto dovodi do smrti B- i T-limfocita periferna krv a samim tim i imunodeficijencije.

Djeca sa takvom bolešću moraju biti zaštićena od bilo kakvih infekcija (čuvati u posebnim sterilnim ćelijama), jer svaka bolest može biti fatalna. 4 godine nakon početka liječenja, dijete je pokazalo ispoljavanje normalno funkcionalne ADA i ublažavanje simptoma SCID, što joj je omogućilo da napusti sterilnu komoru i živi normalnim životom.

Time je dokazana temeljna mogućnost uspješne genetske terapije somatskih stanica. Od 90-ih godina. prolaze kroz ispitivanja genske terapije za brojne genetske bolesti, uključujući tako teške kao što su hemofilija, AIDS, različite vrste maligne neoplazme, cistična fibroza itd. Trenutno se uz pomoć transgeneze može izliječiti oko 10 ljudskih bolesti.

Raznolikost genetskih bolesti predodredila je razvoj mnogih pristupa genskoj terapiji. U ovom slučaju rješavaju se 2 glavna problema: način isporuke terapeutskog gena; metoda za pružanje ciljane isporuke ćelijama namijenjenim za korekciju. Do danas, svi pristupi genskoj terapiji somatskih ćelija mogu se podijeliti u dvije kategorije: ex vivo i in vivo terapija (slika 3.15).

Rice. 3.15. Šema genske terapije ex vivo (a) i in vivo (a)

In vivo genska terapija uključuje isporuku terapeutskog gena direktno u ćelije specifičnog tkiva pacijenta. Razmotrimo ove pristupe detaljnije.

Ex vivo genska terapija uključuje sljedeće korake:
1) dobijanje defektnih ćelija pacijenta i njihovo uzgajanje;
2) transfer željenog gena u izolovane ćelije transfekcijom terapijskog genskog konstrukta;
3) selekcija i rast genetski korigovanih ćelija;
4) transplantaciju ili transfuziju ovih ćelija pacijentu.

Upotreba vlastitih ćelija pacijenta osigurava da nakon što se vrate, pacijent ne razvije imuni odgovor. Procedura transfera genske konstrukcije mora biti efikasna i normalan gen mora biti stabilno održavan i kontinuirano eksprimiran.

Sredstva za prijenos gena koje je stvorila sama priroda su virusi. Da bi se dobili efikasni vektori za isporuku gena, uglavnom se koriste dve grupe virusa - adenovirusi i retrovirusi (slika 3.16). U genskoj terapiji koriste se varijante genetski neutraliziranih virusa.

Rice. 3.16. Virusi koji se koriste za stvaranje terapeutskih vektora

Rice. 3.17. Genetska mapa tipičnog retrovirusa (a) i retrovirusna vektorska mapa (a)

Po prijemu retrovirusnog vektora, u plazmid se ubacuje DNK pune dužine retrovirusa, uklanja se veći dio gag gena i u potpunosti se uklanjaju pol i env geni, a umjesto njih "terapeutski" T gen i , po potrebi se ubacuje marker selektivni Rg gen sa sopstvenim promotorom (slika 3.17, b). Transkripciju T gena će kontrolirati isti jak promotor lokaliziran u 5'-LTR regiji.Na osnovu ove šeme stvoreni su različiti retrovirusni vektori i maksimalna veličina DNK umetka od približno 8 kb.

Ovako dobijeni konstrukt se sam po sebi može koristiti za transformaciju, ali je njegova efikasnost i naknadna integracija u genom ćelije domaćina izuzetno niska. Stoga je razvijena tehnika za pakovanje retrovirusne vektorske RNK pune dužine u intaktne virusne čestice, koje visoka frekvencija prodiru u ćeliju i garantovano će biti integrisani u genom domaćina. Za to je stvorena takozvana "pakovana" ćelijska linija. U dva različita regiona hromozoma ovih ćelija, ušiveni su retrovirusni geni gag i pol-env, lišeni sposobnosti pakovanja zbog nedostatka + (84*+) sekvence (slika 3.18).

Rice. 3.18. Šema za dobijanje upakovanog virusnog vektora

Retrovirusi aktivno inficiraju samo stanice koje se brzo dijele. Za transfer gena, oni se tretiraju sa pročišćenim upakovanim česticama retrovirusnog vektora ili se kultivišu sa ćelijskom linijom koja ih proizvodi, a zatim se bira da odvoji ciljne ćelije i ćelije za pakovanje.

Transducirane stanice se pažljivo provjeravaju na nivo sinteze terapijskog genskog produkta, odsustvo retrovirusa sposobnih za replikaciju, odsustvo promjena u sposobnosti stanica da rastu ili funkcionišu.

Najpogodnije za gensku terapiju su ćelije koštane srži. To je zbog prisustva totipotentnih embrionalnih matičnih stanica u njemu, koje se mogu razmnožavati i diferencirati u različite vrstećelije -B- i T-limfociti, makrofagi, eritrociti, trombociti i osteoklasti. Upravo se te ćelije koriste za liječenje niza nasljednih bolesti, među kojima su već spomenuta teška kombinirana imunodeficijencija, Gaucherova bolest, anemija srpastih stanica, talasemija, osteoporoza itd.

Pored totipotentnih matičnih ćelija koštane srži, koje je teško izolovati i kultivisati, koriste se matične ćelije iz krvi pupčanika (poželjna upotreba za neonatalnu gensku terapiju), kao i ćelije jetre - hepatociti - za lečenje hiperholesterolemije.

U in vivo genskoj terapiji, posebno je važno osigurati isporuku terapeutskog gena do defektnih stanica. Takvu ciljanu isporuku mogu obezbijediti modificirani vektori zasnovani na virusima sposobnim da inficiraju specifične tipove stanica. Razmotrite pristup razvijen za liječenje cistične fibroze koji je već spomenut. Budući da su pluća otvorena šupljina, relativno je lako dostaviti im terapeutske gene. Klonirana varijanta zdravog gena uvedena je u inaktivirani adenovirus (slika 3.19). Specifičnost ove vrste virusa je da inficira sluznicu pluća, izazivajući prehladu.

Rice. 3.19. Shema za dobivanje vektora na bazi adenovirusa

Osim retro- i adenovirusa, u eksperimentima genske terapije koriste se i druge vrste virusa, poput virusa Herpes simplex. Karakteristika ovog dvolančanog (152 kb) DNK virusa je njegova sposobnost da specifično inficira neurone. Postoje mnoge poznate genetske bolesti koje zahvaćaju centralne i periferne nervni sistem- tumori, metabolički poremećaji, neurodegenerativne bolesti (Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest).

Virus herpes simplex Tip I (HSV) je vrlo pogodan vektor za terapiju ovakvih bolesti. Kapsid ovog virusa spaja se sa membranom neurona i njegova DNK se transportuje u jezgro. Predloženo je nekoliko metoda za prijenos terapeutskog gena korištenjem HSV vektora i provedena su uspješna ispitivanja na eksperimentalnim životinjama.

Virusni vektori imaju nekoliko nedostataka: visoku cijenu, ograničen kapacitet kloniranja i moguće upalni odgovor. Tako je 1999. godine, kao rezultat neobično snažnog imunološkog odgovora na uvođenje adenovirusnog vektora, umro 18-godišnji volonter koji je učestvovao u ispitivanjima lijeka. Godine 2002. dvoje djece u Francuskoj razvilo je stanje nalik leukemiji tokom liječenja imunodeficijencije (uvođenjem terapeutskih gena u matične ćelije pomoću retrovirusa).

Stoga se razvijaju nevirusni sistemi za isporuku gena. Najjednostavniji i najneefikasniji način je ubrizgavanje plazmidne DNK u tkiva. Drugi pristup je bombardovanje tkiva zlatnim mikročesticama (1-3 µm) konjugovanim sa DNK. U ovom slučaju, terapeutski geni se eksprimiraju u ciljnim tkivima i njihovi proizvodi - terapeutski proteini - ulaze u krvotok. Glavni nedostatak ovog pristupa je prerana inaktivacija ili uništavanje ovih proteina komponentama krvi.

DNK se može dostaviti pakovanjem u umjetnu lipidnu ljusku. Ovako dobijene sferne čestice-liposomi lako prodiru kroz ćelijsku membranu. Stvoreni su liposomi sa različitim svojstvima, ali je do sada efikasnost takve isporuke niska, jer večina DNK prolazi kroz lizozomsku degradaciju. Također, da bi se isporučio genetski konstrukt, DNK konjugati se sintetiziraju s različitim molekulima koji mogu osigurati njegovu sigurnost, ciljanu isporuku i penetraciju u ćeliju.

Poslednjih godina provode se intenzivni eksperimenti za stvaranje veštačkog 47. hromozoma, koji bi omogućio uključivanje velike količine genetskog materijala sa kompletnim setom regulatornih elemenata za jedan ili više terapeutskih gena. To bi omogućilo korištenje genomske varijante terapeutskog gena i time osiguralo njegovu stabilnost i efikasnu dugoročnu ekspresiju. Izvedeni eksperimenti su pokazali da je stvaranje umjetnog ljudskog hromozoma koji sadrži terapeutske gene sasvim realno, ali još nije jasno kako uvesti tako ogromnu molekulu u jezgro ciljne stanice.

Glavni problemi s kojima se genska terapija susreće, pored rizika od teške imunološke reakcije, su poteškoće dugotrajnog skladištenja i funkcioniranja terapijske DNK u tijelu pacijenta, multigeničnost mnogih bolesti, što ih čini teškom metom gena. terapija i rizik od korištenja virusa kao vektora.

NA. Voinov, T.G. Volova

Uvod

Svake godine u naučnim časopisima se pojavljuje sve više članaka o medicinskim kliničkim studijama, u kojima se, na ovaj ili onaj način, koristio tretman zasnovan na uvođenju različitih gena – genska terapija. Ovaj pravac je izrastao iz tako dobro razvijenih grana biologije kao što su molekularna genetika i biotehnologija.

Često, kada su konvencionalne (konzervativne) metode već isprobane, genska terapija može pomoći pacijentima da prežive, pa čak i da se potpuno oporave. Na primjer, ovo se odnosi na nasljedne monogene bolesti, odnosno one uzrokovane defektom jednog gena, kao i mnoge druge. Ili, na primjer, genska terapija može pomoći i spasiti ud onim pacijentima koji imaju sužen vaskularni lumen u donjih udova i kao rezultat toga, razvila se trajna ishemija okolnih tkiva, odnosno ta tkiva su ozbiljno deficitarna hranljive materije i kiseonik, koji se normalno prenose krvlju kroz tijelo. Takve pacijente je često nemoguće liječiti hirurškim manipulacijama i lijekovima, ali ako su stanice lokalno prisiljene da izbacuju više proteinskih faktora koji bi utjecali na proces formiranja i klijanja novih žila, tada bi ishemija postala mnogo manje izražena i postala bi pacijentima je mnogo lakše živjeti.

genska terapija danas se može definirati kao liječenje bolesti uvođenjem gena u ćelije pacijenata s ciljem ciljanja genskih defekta ili davanja ćelijama novih funkcija. Prva klinička ispitivanja metoda genske terapije poduzeta su tek 22. maja 1989. u cilju dijagnosticiranja raka. Prvo nasledna bolest, u odnosu na koje su primijenjene metode genske terapije, pokazalo se kao nasljedna imunodeficijencija.

Svake godine broj uspješno provedenih kliničkih ispitivanja liječenja razne bolesti uz korištenje genske terapije raste, te je do januara 2014. dostigao 2 hiljade.

Istovremeno, u savremenim istraživanjima genske terapije, mora se uzeti u obzir da su posledice manipulisanja genima ili „promešane“ (rekombinantne) DNK in vivo(lat. doslovno "živ") nisu dovoljno proučavani. U zemljama s najnaprednijim nivoom istraživanja u ovoj oblasti, posebno u Sjedinjenim Državama, medicinski protokoli koji koriste čulne DNK sekvence podliježu obaveznom ispitivanju u relevantnim komitetima i komisijama. U Sjedinjenim Državama to su Savjetodavni komitet za rekombinantnu DNK (RAC) i Uprava za hranu i lijekove (FDA) uz naknadno obavezno odobrenje projekta od strane direktora Nacionalnog instituta za zdravlje (National Institutes of Health).

Dakle, odlučili smo da se ovaj tretman zasniva na činjenici da ako nekim tkivima tijela nedostaju neki pojedinačni proteinski faktori, onda se to može ispraviti uvođenjem odgovarajućih gena koji kodiraju proteine ​​u ta tkiva i sve će postati manje-više divno . Neće biti moguće uvesti same proteine, jer će naše tijelo odmah reagovati imuni odgovor, a trajanje djelovanja bi bilo nedovoljno. Sada moramo odlučiti o metodi isporuke gena u ćelije.

Transfekcija ćelije

Za početak, vrijedi uvesti definicije nekih pojmova.

Transport gena vrši se vektor je DNK molekul koji se koristi kao " vozilo» za vještački prijenos genetskih informacija u ćeliju. Postoji mnogo tipova vektora: plazmidni, virusni, kao i kozmidi, fazmidi, veštački hromozomi, itd. Od fundamentalne je važnosti da vektori (posebno plazmidni vektori) imaju svoja karakteristična svojstva:

1. Porijeklo replikacije (ori)- nukleotidna sekvenca na kojoj počinje duplikacija DNK. Ako se vektorska DNK ne može duplicirati (replicirati), onda je neophodno lekovito dejstvo neće biti postignuta, jer će se jednostavno brzo odcijepiti intracelularnim nukleaznim enzimima, a zbog nedostatka šablona na kraju će se formirati mnogo manje proteinskih molekula. Treba napomenuti da su ove točke specifične za svaku biološku vrstu, odnosno ako se DNK vektora treba dobiti njegovom reprodukcijom u bakterijskoj kulturi (a ne samo hemijska sinteza, što je obično mnogo skuplje), tada će biti potrebna dva odvojena izvora replikacije - za ljude i za bakterije;

2. Mjesta ograničenja- specifične kratke sekvence (obično palindromne), koje prepoznaju posebni enzimi (restrikcione endonukleaze) i njima se na određeni način režu - sa formiranjem "lepljivih krajeva" (slika 1).

Slika 1. Formiranje "ljepljivih krajeva" uz učešće restriktaza

Ova mjesta su neophodna kako bi se vektorska DNK (koja je zapravo "prazna") povezala sa željenim terapeutskim genima u jedan molekul. Takav molekul umrežen iz dva ili više dijelova naziva se "rekombinantni";

3. Jasno je da bismo željeli dobiti milione kopija rekombinantnog molekula DNK. Opet, ako imamo posla sa kulturom bakterijskih ćelija, onda se ova DNK mora dalje izolovati. Problem je što neće sve bakterije progutati molekule koje su nam potrebne, neke neće. Da bi se razlikovale ove dvije grupe, one se ubacuju u vektorsku DNK selektivni markeri- područja otpornosti na određene hemikalije; sada, ako se te iste supstance dodaju u okolinu, onda će preživjeti samo one koje su otporne na njih, a ostale će umrijeti.

Sve ove tri komponente se mogu uočiti u prvom veštački sintetizovanom plazmidu (slika 2).

Fig.2

Sam proces uvođenja plazmidnog vektora u određene ćelije naziva se transfekcija. Plazmid je prilično kratka i obično kružna molekula DNK koja se nalazi u citoplazmi bakterijske ćelije. Plazmidi nisu povezani sa bakterijskim hromozomom, mogu se replicirati nezavisno od njega, bakterija ih može izbaciti u okruženje ili, obrnuto, biti apsorbiran (proces apsorpcije - transformacija). Uz pomoć plazmida, bakterije mogu razmjenjivati ​​genetske informacije, na primjer, prenositi otpornost na određene antibiotike.

Plazmidi postoje u bakterijama in vivo. Ali niko ne može spriječiti istraživača da umjetno sintetizira plazmid koji će imati svojstva koja su mu potrebna, u njega ušiti umetnuti gen i uvesti ga u ćeliju. U isti plazmid mogu se umetnuti različiti umetci .

Metode genske terapije

Postoje dva glavna pristupa koji se razlikuju po prirodi ciljnih ćelija:

1. Fetalni, kod kojeg se strana DNK unosi u zigotu (oplođeno jaje) ili embrion na rana faza razvoj; u ovom slučaju se očekuje da će uneseni materijal ući u sve ćelije primaoca (pa čak i u zametne ćelije, čime će se osigurati prijenos na sljedeću generaciju). Kod nas je to zapravo zabranjeno;

2. Somatski, u kojem se genetski materijal unosi u nespolne ćelije već rođenih i ne prenosi se na zametne ćelije.

Genska terapija in vivo zasniva se na direktnom uvođenju kloniranih (umnoženih) i specifično upakovanih DNK sekvenci u određena tkiva pacijenta. Posebno obećavajuće za liječenje genskih bolesti in vivo je uvođenje gena korištenjem aerosola ili injekcijskih vakcina. Aerosol genska terapija se u pravilu razvija za liječenje plućnih bolesti (cistična fibroza, rak pluća).

Razvoju programa genske terapije prethodi mnogo faza. Ovo uključuje detaljnu analizu tkivno specifične ekspresije odgovarajućeg gena (tj. sintezu na matrici gena nekog proteina u određenom tkivu), i identifikaciju primarnog biohemijskog defekta, te proučavanje strukture, funkcije i intracelularna distribucija njegovog proteinskog proizvoda, kao i biohemijske analize patološki proces. Svi ovi podaci se uzimaju u obzir pri izradi odgovarajućeg medicinskog protokola.

Važno je da se prilikom izrade šema korekcije gena, efikasnost transfekcije, stepen korekcije primarnog biohemijskog defekta u uslovima ćelijske kulture ( in vitro,"in vitro") i, što je najvažnije, in vivo na životinjskim biološkim modelima. Tek tada može započeti program kliničkog ispitivanja. .

Direktna isporuka i ćelijski nosioci terapijskih gena

Postoji mnogo metoda za uvođenje strane DNK u eukariotsku ćeliju: neke ovise o fizičkoj obradi (elektroporacija, magnetofekcija, itd.), druge o primjeni hemijski materijali ili biološke čestice (npr. virusi) koje se koriste kao nosioci. Vrijedi odmah spomenuti da se kemijske i fizičke metode obično kombiniraju (na primjer, elektroporacija + omotavanje DNK liposomima)

Direktne metode

1. Transfekcija zasnovana na hemikalijama može se klasifikovati u nekoliko tipova: upotrebom ciklodekstrinske supstance, polimera, liposoma ili nanočestica (sa ili bez hemijske ili virusne funkcionalizacije, tj. modifikacije površine).
a) Jedna od najjeftinijih metoda je upotreba kalcijum fosfata. Povećava efikasnost ugradnje DNK u ćelije za 10-100 puta. DNK formira jak kompleks sa kalcijumom, koji obezbeđuje njegovu efikasnu apsorpciju. Nedostatak je što samo oko 1 - 10% DNK dospijeva u jezgro. Korištena metoda in vitro da prenese DNK u ljudske ćelije (slika 3);

Fig.3

b) Upotreba visoko razgranatih organskih molekula - dendrimera, da vežu DNK i prenesu je u ćeliju (slika 4);

Fig.4

c) Veoma efikasna metoda za transfekciju DNK je njeno uvođenje kroz liposome - mala tijela okružena membranom koja se mogu spojiti sa ćelijskom citoplazmatskom membranom (CPM), koja je dvostruki sloj lipida. Za eukariotske ćelije, transfekcija je efikasnija s kationskim liposomima jer su ćelije osjetljivije na njih. Proces ima svoje ime - lipofekcija. Ova metoda se danas smatra jednom od najsigurnijih. Liposomi su netoksični i neimunogeni. Međutim, efikasnost prijenosa gena korištenjem liposoma je ograničena, jer se DNK koju oni unose u stanice obično odmah hvataju lizozomi i uništavaju. Uvođenje DNK u ljudske ćelije uz pomoć liposoma je danas glavni oslonac terapije. in vivo(sl.5);

Sl.5

d) Druga metoda je upotreba katjonskih polimera kao što su dietilaminoetil-dekstran ili polietilenimin. Negativno nabijeni molekuli DNK vezuju se za pozitivno nabijene polikatione, a ovaj kompleks zatim endocitozom ulazi u ćeliju. DEAE-dekstran promjene fizička svojstva plazma membranu i stimuliše uzimanje ovog kompleksa od strane ćelije. Glavni nedostatak metode je što DEAE-dekstran ulazi visoke koncentracije toksično. Metoda nije dobila distribuciju u genskoj terapiji;

e) Uz pomoć histona i drugih nuklearnih proteina. Ovi proteini, koji sadrže mnogo pozitivno nabijenih aminokiselina (Lys, Arg), u prirodnim uvjetima pomažu kompaktnom pakovanju dugog DNK lanca u relativno malo jezgro ćelije.

2. Fizičke metode:

a) Elektroporacija je veoma popularna metoda; trenutno povećanje propusnosti membrane postiže se zbog činjenice da su ćelije podvrgnute kratkotrajnom izlaganju jakom električnom polju. Pokazalo se da pod optimalnim uslovima broj transformanata može dostići 80% preživelih ćelija. Trenutno se ne koristi na ljudima (slika 6).

Fig.6

b) "Cell squeezing" - metoda izumljena 2013. Omogućava vam da dopremate molekule do ćelija "mekim stiskanjem" ćelijske membrane. Metoda eliminira mogućnost toksičnosti ili pogrešnog pogotka na meti, jer ne ovisi o vanjskim materijalima ili električnim poljima;

c) Sonoporacija - metoda vještačkog prenosa stranog DNK u ćelije izlaganjem ultrazvuku, što uzrokuje otvaranje pora u ćelijskoj membrani;
d) Optička transfekcija – metoda u kojoj se u membrani napravi sićušna rupa (oko 1 µm u prečniku) korišćenjem visoko fokusiranog lasera;
e) Hidrodinamička transfekcija - metoda za isporuku genetskih konstrukata, proteina itd. kontroliranim porastom tlaka u kapilarama i intersticijskoj tekućini, što uzrokuje kratkotrajno povećanje permeabilnosti ćelijskih membrana i stvaranje privremenih pora u njima. Izvodi se brzom injekcijom u tkivo, dok je isporuka nespecifična. Efikasnost isporuke za skeletne mišiće - 22 do 60% ;

f) DNK mikroinjekcija - uvođenje u jezgro životinjskih ćelija pomoću tankih staklenih mikrotubula (d=0,1-0,5 µm). Nedostatak je složenost metode, velika je vjerovatnoća uništenja jezgra ili DNK; ograničen broj ćelija se može transformisati. Ne koristi se za ljude.

3. Metode zasnovane na česticama.

a) Direktan pristup transfekciji je genski pištolj, u kojem se DNK spaja u nanočesticu s inertnim čvrstim tvarima (obično zlato, volfram), koje zatim "pucaju" usmjerene na jezgra ciljnih stanica. Ova metoda se primjenjuje in vitro i in vivo za uvođenje gena, posebno u ćelije mišićnog tkiva, na primjer, kod bolesti kao što je Duchenneova miodistrofija. Veličina čestica zlata je 1-3 mikrona (slika 7).

Fig.7

b) Magnetofekcija – metoda koja koristi sile magnetizma za isporuku DNK do ciljnih stanica. Prvo se nukleinske kiseline (NA) povezuju sa magnetnim nanočesticama, a zatim se pod dejstvom magnetnog polja čestice ubacuju u ćeliju. Učinkovitost je gotovo 100%, zabilježena je očigledna netoksičnost. Već nakon 10-15 minuta, čestice se registruju u ćeliji - to je mnogo brže od drugih metoda.
c) Impalefection (nabijanje na kolac; "nabijanje", bukvalno "nabijanje" + "infekcija") - metoda isporuke koja koristi nanomaterijale kao što su ugljenične nanocevi i nanovlakna. U ovom slučaju, ćelije su bukvalno probijene slojem nanofibrila. Prefiks "nano" se koristi za označavanje njihovih vrlo malih veličina (unutar milijarditih delova metra) (slika 8).

Fig.8

Odvojeno, vrijedi istaknuti metodu kao što je RNA transfekcija: u ćeliju se ne isporučuje DNK, već molekule RNK - njihovi "nasljednici" u lancu biosinteze proteina; istovremeno se aktiviraju posebni proteini koji režu RNK na kratke fragmente – tzv. mala interferirajuća RNK (siRNA). Ovi fragmenti se vezuju za druge proteine ​​i, na kraju, to dovodi do inhibicije ekspresije odgovarajućih gena od strane ćelije. Tako je moguće blokirati djelovanje onih gena u ćeliji koji u ovom trenutku potencijalno mogu učiniti više štete nego koristi. RNA transfekcija je našla široku primjenu, posebno u onkologiji.

Razmatraju se osnovni principi isporuke gena pomoću plazmidnih vektora. Sada možemo prijeći na razmatranje virusnih metoda. Virusi su nećelijski oblici života, najčešće molekula nukleinske kiseline (DNK ili RNK) umotana u proteinski omotač. Ako iz genetskog materijala virusa izrežemo sve one sekvence koje uzrokuju nastanak bolesti, onda se i cijeli virus može uspješno pretvoriti u “vozilo” za naš gen.

Proces uvođenja DNK u ćeliju, posredovan virusom, naziva se transdukcija.
U praksi se najčešće koriste retrovirusi, adenovirusi i adeno-asociirani virusi (AAV). Za početak, vrijedno je shvatiti koji bi trebao biti idealan kandidat za transdukciju među virusima. Kriterijumi su da mora biti:

stabilan;
. kapacitet, odnosno da sadrži dovoljnu količinu DNK;
. inertan u odnosu na metaboličke puteve ćelije;
. tačan - idealno bi trebalo da integriše svoj genom u određeni lokus genoma jezgra domaćina, itd.

U stvarnom životu je vrlo teško kombinovati barem nekoliko tačaka, tako da se obično do izbora javlja kada se svaki pojedinačni slučaj posebno razmatra (slika 9).

Fig.9

Od tri navedena virusa koji se najčešće koriste, AAV je najsigurniji i istovremeno najprecizniji. Gotovo jedini nedostatak im je relativno mali kapacitet (oko 4800 bp), što se, međutim, pokazalo dovoljnim za mnoge gene .

Pored navedenih metoda, genska terapija se često koristi u kombinaciji sa ćelijskom terapijom: prvo se kultura određenih ljudskih ćelija posadi u hranljivi medij, zatim se potrebni geni na ovaj ili onaj način unose u ćelije, uzgajaju za neko vrijeme i ponovo presađen u organizam domaćina. Kao rezultat, ćelije se mogu vratiti svojim normalnim svojstvima. Tako su, na primjer, ljudska bijela krvna zrnca (leukociti) modificirana u leukemiji (slika 10).

Fig.10

Sudbina gena nakon što uđe u ćeliju

Pošto je sa virusnim vektorima sve manje-više jasno zbog njihove sposobnosti da efikasnije isporuče gene do konačnog cilja - jezgre, zadržaćemo se na sudbini plazmidnog vektora.

U ovoj fazi smo postigli da je DNK prošla prvu veliku barijeru – citoplazmatsku membranu ćelije.

Dalje, u kombinaciji s drugim supstancama, obloženima ili ne, ona treba postići ćelijsko jezgro tako da poseban enzim - RNA polimeraza - sintetiše molekulu RNK (mRNA) na DNK šablonu (ovaj proces se naziva transkripcija). Tek nakon toga, mRNA će ući u citoplazmu, formirati kompleks sa ribozomima i, prema genetski kod sintetizira se polipeptid - na primjer, vaskularni faktor rasta (VEGF), koji će početi obavljati određenu terapeutsku funkciju (u ovom slučaju će započeti proces formiranja vaskularnog grananja u tkivu sklonom ishemiji).

Što se tiče ekspresije uvedenih gena u željeni tip ćelije, ovaj problem se rešava uz pomoć transkripcionih regulatornih elemenata. Tkivo u kojem dolazi do ekspresije često je određeno kombinacijom tkivno specifičnog pojačivača („pojačavajuća” sekvenca) sa određenim promotorom (nukleotidna sekvenca od koje RNA polimeraza počinje sintezu), koji može biti inducibilan. . Poznato je da se aktivnost gena može modulirati in vivo vanjskim signalima, a budući da pojačivači mogu raditi sa bilo kojim genom, u vektore se mogu uvesti i izolatori, koji pomažu pojačivaču da radi bez obzira na njegovu poziciju i može se ponašati kao funkcionalna barijera između gena. Svaki pojačivač sadrži skup vezivnih mjesta za aktivaciju ili supresiju proteinskih faktora. Promotori takođe mogu regulisati nivo ekspresije gena. Na primjer, postoje metalotionein ili temperaturno osjetljivi promoteri; hormonski vođeni promoteri.

Ekspresija gena zavisi od njegove pozicije u genomu. U većini slučajeva, postojeće virusne metode dovode samo do slučajnog umetanja gena u genom. Da bi se eliminisala takva zavisnost, pri konstruisanju vektora, gen se obezbeđuje poznatim nukleotidnim sekvencama koje omogućavaju ekspresiju gena bez obzira na mesto njegovog umetanja u genom.

Najjednostavniji način da se reguliše ekspresija transgena je da mu se obezbedi indikatorski promotor koji je osetljiv na fiziološki signal kao što je oslobađanje glukoze ili hipoksija. Takvi "endogeni" kontrolni sistemi mogu biti korisni u nekim situacijama, kao što je kontrola proizvodnje insulina zavisna od glukoze. Pouzdaniji i svestraniji su "egzogeni" kontrolni sistemi, kada se ekspresija gena kontrolira farmakološki uvođenjem male molekule lijeka. Trenutno su poznata 4 glavna kontrolna sistema - regulisana tetraciklinom (Tet), steroidom za insekte, ekdizonom ili njegovim analozima, antiprogestinskim lekom maifpristonom (RU486) i hemijskim dimerizatorima kao što je rapamicin i njegovi analozi. Svi oni uključuju regrutaciju domene aktivacije transkripcije u zavisnosti od lijeka do glavnog promotora koji vodi željeni gen, ali se razlikuju po mehanizmima ovog regrutiranja. .

Zaključak

Pregledom podataka dolazi se do zaključka da su, uprkos naporima mnogih laboratorija u svijetu, svi već poznati i ispitani in vivo i in vitro vektorski sistemi su daleko od savršenih . Ako je problem isporuke stranog DNK in vitro praktično riješen, i njegova isporuka do ciljnih stanica različitih tkiva in vivo uspješno riješene (uglavnom stvaranjem konstrukta koji nose receptorske proteine, uključujući antigene specifične za određena tkiva), onda su ostale karakteristike postojećih vektorskih sistema - stabilnost integracije, regulirana ekspresija, sigurnost - i dalje potrebna ozbiljna poboljšanja.

Prije svega, to se tiče stabilnosti integracije. Do sada je integracija u genom postignuta samo pomoću retrovirusnih ili adeno-asociranih vektora. Efikasnost stabilne integracije može se povećati poboljšanjem genskih konstrukcija kao što su sistemi posredovani receptorima ili stvaranjem dovoljno stabilnih epizomalnih vektora (tj. struktura DNK sposobne za dugotrajan boravak unutar jezgara). U posljednje vrijeme posebna pažnja se posvećuje stvaranju vektora na bazi umjetnih hromozoma sisara. Zbog prisustva osnovnih strukturnih elemenata običnih hromozoma, takvi mini hromozomi se dugo zadržavaju u ćelijama i mogu nositi gene pune veličine (genomske) i njihove prirodne regulatorne elemente, koji su neophodni za pravilno funkcionisanje. gena, u pravom tkivu iu pravo vrijeme.

Genska i ćelijska terapija otvara blistave izglede za obnavljanje izgubljenih stanica i tkiva i genetski inženjering dizajn organa, što će nesumnjivo značajno proširiti arsenal metoda za biomedicinska istraživanja i stvoriti nove mogućnosti za očuvanje i produženje ljudskog života.

30. avgusta 2017 prehrambeni proizvodi i Agencija za lijekove (FDA) odobrila je prvu gensku terapiju za rak krvi na svijetu. Ovo je Kymriah (tisagenlecleucel) iz Novartis Pharmaceuticals, koji je zasnovan na CAR-T tehnologiji i namijenjen je liječenju B-ćelijske akutne limfoblastne leukemije kod djece i mladih do 25 godina starosti koji su otporni na druge tretmane ili koji imaju relaps bolesti.

Upotreba CRISPR/Cas9 tehnologije za uređivanje genoma otvara nove mogućnosti u genskoj terapiji. CRISPR/Cas9 vam omogućava da vrlo precizno i ​​bezbedno promenite DNK ćelija. A ako kombiniramo tehnologiju CRISPR/Cas9 s isporukom pomoću adeno-povezanih virusa, onda će to, očigledno, omogućiti sistemski učinak na tijelo i potpuno sigurno promijeniti genom vrlo velikog broja ćelija.

A 2016. godine genetičari sa Univerziteta Duke (SAD) objavili su da su po prvi put u istoriji uspjeli uspješno provesti gensku terapiju odraslog sisara (miša) i izliječiti ga od genetske bolesti povezane s mišićnom distrofijom. Za to je modificirana verzija komparativno nova tehnologija uređivanje CRISPR/Cas9 gena. Tehnologija za uređivanje gena CRISPR/Cas9 uključuje korištenje virusa povezanog s adeno kako bi se genetski materijal dostavio na odredište. Koristeći ovu tehnologiju, izvedeni su uspješni eksperimenti za uređivanje gena pojedinačnih stanica u epruvetama i jednoćelijskim embrionima. Nažalost, do sada je mogućnost genetske manipulacije na ljudskim embrionima predmet žestokih kontroverzi.

CRISPR/Cas je nadmašio sva očekivanja. Omogućio je, uz minimalan broj grešaka, i da se "isključe" potrebni geni i da se integrišu novi geni u strogo definisane regione genoma.

U decembru 2015. istraživački tim Feng Janga modificirao je ovaj sistem tako da je postao potpuno bez grešaka, što je objavljeno u vodećim naučni časopis Nauka. Naučnici su u Cas9 endonukleazi zamijenili 3 aminokiseline (građevinski blokovi koji čine protein) nakon čega je broj grešaka u takvom sistemu smanjen na gotovo nulu.

Upotreba CRISP/Cas9 posebno je relevantna za gensku terapiju starenja, gdje je potrebno utjecati na puteve dugovječnosti uobičajene za većinu tjelesnih ćelija. Do 2015. godine nisu provedena klinička ispitivanja na ljudima genske terapije za starenje, što i ne čudi, budući da starenje još nije prepoznato kao bolest.

Osim toga, genska terapija za starenje je još uvijek vrlo mlada oblast koja se razvija. Sada se sve studije o genskoj terapiji starenja provode na modelima miševa, pacova, majmuna i kultura ljudskih ćelija - ćelija in vitro.

Svi pristupi genskoj terapiji starenja dijele se na one gdje se gen za dugovječnost isporučuje u tijelo i na one gdje se unose male RNK koje „isključuju“ gen ili put starenja. Odnosno, u prvom slučaju se uvodi nešto korisno za dugovječnost, a u drugom se isključuje štetno. Strogo govoreći, postojale su samo dvije studije genske terapije starenja kod sisara do 2015.

Mnogo više radova model genske terapije kod transgenih miševa. U takvim studijama terapeutski gen se ne unosi u tijelo odraslog miša, već se uz pomoć genetskog inženjeringa stvaraju miševi čiji je genom promijenjen od rođenja. Kao i genska terapija, ovo vam omogućava da istražite kako povećanje ili smanjenje aktivnosti različitih gena utiče na životni vijek i starenje tijela.

Pogledajmo šta bi genska terapija i genetski inženjering teoretski mogli učiniti u borbi protiv starenja.

Prednost genske terapije u odnosu na druge metode produženja života

Dakle, ako govorimo o prevođenju istraživanja o produženju života na ljude, onda genska terapija ima apsolutnu prednost, jer ne smanjuje kvalitetu života zbog potrebe. trajni tretman- svakodnevno se pridržavajte određene dijete ili stalno koristite geroprotektore ili druge lijekove. Također, genska terapija je visoko ciljana i stoga ima potencijal za manje nuspojava.

osim toga, lijekovi imaju ograničenu bioraspoloživost u različitim tkivima i organima.

Uvođenje gena za telomerazu (TERT) kod dvogodišnjih miševa divljeg tipa (40-50 godina u ljudskom smislu) jednom injekcijom povećava dužinu telomera i produžava im život za 20%.

Naučnik je sugerisao da postoji određeni brojač podela u ćelijama, koji ograničava njihov ukupan broj. 10 godina kasnije, ruski naučnik Aleksej Olovnikov predložio je hipotetički mehanizam za rad ovog brojača.

Olovnikov je sugerirao da se tokom diobe ćelije krajevi hromozoma, zvani telomeri, blago skraćuju. A kada telomeri dostignu kritičnu dužinu, ćelija prestaje da se deli i stari. Nakon toga, Elizabeth Helen Blackburn, američka citogenetičarka, postala je laureat nobelova nagrada doktorirao fiziologiju i medicinu 2009. godine, zajedno sa Carol Greider i Jackom Szostakom, uz tekst "za otkriće mehanizama za zaštitu hromozoma telomerima i enzimom telomerazom" prema teoriji koju je 1971. predložio Aleksej Olovnikov.

U ćelijama koje ne stare (kao što su zametne i embrionalne matične ćelije), naprotiv, mora postojati enzim koji produžava telomere, omogućavajući ćelijama da se dele gotovo neograničeno. Osim toga, pokazalo se da oštećenje gena telomeraze uvelike skraćuje život modelnih životinja i dovodi do pojave sindroma preranog starenja - progerije.

Nakon otkrića telomeraze, desetine naučnika krenulo je u pokušaj da na osnovu nje napravi lijek za starost. Čini se da „uključivanje“ telomeraze u svim ćelijama može učiniti telo besmrtnim. Međutim, ubrzo su se pojavili strahovi zbog činjenice da je aktivna sinteza telomeraze uočena u 90% kancerozni tumori. Postavilo se pitanje: da li bi aktivacija telomeraze dovela do rizika od maligne transformacije?

Osim toga, pokazalo se da starenje stanica nije uvijek praćeno smanjenjem telomera. Na primjer, u slučaju epitelnih stanica oralne sluznice ili rožnice ljudskog oka. Ovo sugerira da samo aktivacija telomeraze možda neće biti dovoljna za podmlađivanje cijelog tijela. Prije prelaska na gensku terapiju, učinci telomeraze su proučavani na transgenim miševima. Ispostavilo se da ako "uključite" gen TERT u svim ćelijama miša, onda se očekivani životni vijek povećava za 40%! Međutim, stalna aktivnost telomeraze takođe povećava rizik od raka. Stoga se postavilo pitanje kako aktivirati rad telomeraze na kraći period.

Danas se telomeraza može stimulisati i lekovima. Zanimljivo istraživanje u ovoj oblasti sproveli su naučnici sa Univerziteta u Ljubljani (Slovenija) 2016. godine nakon niza uspješnih kliničkih ispitivanja o vaskularnom podmlađivanju niskim dozama valsartana i fluvastatina. Ovaj put su mjerili aktivnost telomeraze nakon vaskularnog podmlađivanja u uzorcima krvi 130 pacijenata.

Dakle, jednomjesečni kurs značajno povećava aktivnost telomeraze za 3,28 puta, što značajno korelira s poboljšanjem funkcije endotela (vaskularno pomlađivanje) i smanjenjem upale u krvnim žilama. I ovaj povišen nivo telomeraza opstaje, postepeno se smanjuje, još šest mjeseci. Ali koliko efikasno takvo povećanje telomeraze utiče na telomere ostaje da se utvrdi.

Važno je znati da telomeri ne mogu nužno produžiti naš život ako se takva terapija ne radi u pravo vrijeme i predugo.

Osim toga, samo stimulacija telomeraze ne može produžiti telomere. Aktivnost telomeraze se gotovo ne mijenja s godinama - pogledajte grafikon s lijeve strane. A telomeri se i dalje smanjuju.

Danas je na tržištu i lijek koji povećava aktivnost telomeraze - TA-65. Veoma je skup, a život miševa se u studijama nije ni na koji način produžio. Ovdje pogledajte grafikon lijevo. U studiji iz 2011. naučnici iz španskog nacionalnog Cancer Center počeo davati dugovječnim dvogodišnjim miševima TA-65 za povećanje telomeraze, kao u prethodnoj studiji. Samo u prethodnoj studiji, miševima je ubrizgana genska terapija. Ali lijek TA-65 nije ni na koji način produžio život miševima, za razliku od genske terapije (vidi grafikon lijevo) i bio je potpuno beskoristan za produžavanje života i usporavanje starenja.

Naučnici sa Univerziteta Teksas su 2011. proučavali telomere i telomerazu u ćelijskim kulturama više od 60 vrsta sisara. Pokazalo se da uloga telomera u dugovečnosti nije toliko očigledna... Studije pokazuju (kada se uporedi oko 60 vrsta sisara), što su telomeri duži u nekoj vrsti, to se u njoj brže akumuliraju mutacije DNK, više tumora raka i kraći životni vek . Dužina telomera je u obrnutoj korelaciji sa životnim vekom. Ovo sugerira da rezultat produženja života telomeraze, koji je dobiven kod miševa jednom injekcijom, možda neće produžiti život ljudima. Pitanje telomera za ljude ostaje otvoreno.

zaključak: U budućnosti ćemo, teoretski, moći da povećamo dužinu telomera uz pomoć uvođenja gena za telomerazu (TERT) u dobi od 40-50 godina jednom injekcijom, ali sama takva terapija očito nije dovoljna . Najbrže moramo pronaći kombinaciju efekata genske terapije kako bismo značajno produžili ljudski život. Danas možemo oponašati učinak jednomjesečnom, šestomjesečnom kombinacijom lijekova. valsartan 20 mg + fluvastatin 10-20 mg, ili telmisartan + atorvastatin 10 mg. Barem ovi lijekovi u kombinaciji mogu stimulirati samu telomerazu.

Poremećaj gena Agtr1a koji kodira angiotenzin AT1a receptore produžava život transgenih miševa za 26% u poređenju sa miševima divljeg tipa.

Kaplan je, koristeći primjer primata, pokazao da ako prikupite grupu muških primata, onda će u roku od nekoliko dana majmuni imati društvenu hijerarhiju. Najgore mjesto u takvoj hijerarhiji je na dnu. Mužjaci primata u podređenom položaju pokazuju niz pokazatelja kroničnog stresa. Često razvijaju aterosklerozu. Kada su naučnici dali muškim primatima na dnu društvene hijerarhije (u riziku) beta-blokator propranolol potiskujući aktivnost simpatičkog nervnog sistema, tada se nije razvila vaskularna ateroskleroza.

Ispostavilo se da simpatički nervni sistem, zbog stresa, negativno utiče na razvoj ateroskleroze i uključen je u probleme sa srcem i krvnim sudovima. Emocionalni stres se manifestira kroz simpatički (adrenergični) autonomni nervni sistem, koji povezuje kontrolne centre našeg mozga i unutrašnje organe. Uključujući - sa imunim, koštana srž i dr. Ateroskleroza je glavni faktor koji dovodi do najvećeg broja smrtnih slučajeva u razvijenim zemljama od srčanog infarkta i moždanog udara.

Randomizirana, dvostruko slijepa, placebom kontrolirana studija iz 1983. godine koju su organizirali Goldstein S i kolege pokazala je da terapija propranolol kod 3837 pacijenata sa akutnim infarktom miokarda smanjuje smrtnost od kardiovaskularnih bolesti (broj 1 uzrok smrti u svijetu).

U martu 2017. francuski naučnici su prijavili uspješna klinička ispitivanja genske terapije za liječenje anemije srpastih stanica.

Komitet Američke nacionalne akademije nauka i Nacionalne akademije medicine dali su podršku za uređivanje genoma ljudskih embriona još 2017. Ali samo za ozbiljne bolesti i pod strogom kontrolom.

zaključci

1. Svi pristupi genskoj terapiji starenja dijele se na one gdje se gen za dugovječnost dostavlja tijelu i na one gdje je gen ili put starenja „isključen“.

2. U poređenju sa drugim pristupima produženja života, gensku terapiju treba uraditi samo jednom u životu.

3. Umetanje gena telomeraze (TERT), poremećaj Agtr1a gena, GHRKO nokaut, poremećaj u genima koji kodiraju IGF-1 receptore, prekomjerna ekspresija FGF21, nokaut AC5, delecija RIP3, uređivanje gena PCSK9, prekomjerna ekspresija Klotho1, prekomjerna ekspresija RAGE kR izraz, MTH1 prekomjerna ekspresija su svi primjeri od većine efikasne načine genetski inženjering ili genska terapija za produžavanje života životinja.

4. Za postizanje značajnijih rezultata u genskoj terapiji starenja i genetskom inženjeringu protiv starenja potrebno je kombinovati različite pristupe. Dodaj oznake

Genska terapija je liječenje nasljednog, nenasljednog, koji se provodi unošenjem drugih gena u ćelije pacijenta. Cilj terapije je eliminirati genske defekte ili dati stanicama nove funkcije. Mnogo je lakše uvesti zdrav, potpuno funkcionalan gen u ćeliju nego ispraviti defekte u postojećoj.

Genska terapija je ograničena na studije u somatskim tkivima. To je zbog činjenice da svaka intervencija u spolnim i zametnim stanicama može dati potpuno nepredvidiv rezultat.

Tehnika koja se trenutno koristi je efikasna u liječenju kako monogenih tako i multifaktorskih bolesti (maligni tumori, neke vrste teških kardiovaskularnih, virusnih bolesti).

Oko 80% svih projekata genske terapije odnosi se na HIV infekciju i trenutno se istražuju kao što su hemofilija B, cistična fibroza, hiperholesterolemija.

Tretman uključuje:

izolacija i razmnožavanje pojedinačnih tipova ćelija pacijenata;

uvođenje stranih gena;

selekcija ćelija u kojima se „ukorijenio“ strani gen;

Njihova implantacija pacijentu (na primjer, putem transfuzije krvi).

Genska terapija se zasniva na uvođenju klonirane DNK u tkiva pacijenta. po najviše efikasne metode ovo uključuje injekcione i aerosolne vakcine.

Genska terapija djeluje na dva načina:

1. Liječenje monogenih bolesti. To uključuje poremećaje u mozgu, koji su povezani s bilo kojim oštećenjem stanica koje proizvode neurotransmitere.

2. Tretman Glavni pristupi koji se koriste u ovoj oblasti su:

genetsko poboljšanje imune ćelije;

povećanje imunoreaktivnosti tumora;

blok ekspresije onkogena;

zaštita zdravih ćelija od kemoterapije;

uvođenje tumor supresorskih gena;

proizvodnja antikancerogenih supstanci od strane zdravih stanica;

proizvodnja antitumorskih vakcina;

lokalna reprodukcija normalnih tkiva uz pomoć antioksidanata.

Upotreba genske terapije ima brojne prednosti i u nekim slučajevima je jedina šansa za normalan život za bolesne ljude. Međutim, ovo područje nauke nije u potpunosti istraženo. Postoji međunarodna zabrana testiranja spolnih i zametnih stanica prije implantacije. Ovo se radi kako bi se spriječile neželjene genske konstrukcije i mutacije.

Neki uslovi pod kojima su dozvoljena klinička ispitivanja su razvijeni i opšte priznati:

Gen koji se prenosi u ciljne ćelije mora biti aktivan dugo vremena.

U stranoj sredini gen mora zadržati svoju efikasnost.

Transfer gena ne bi trebao izazvati negativne reakcije u tijelu.

Postoji niz pitanja koja i danas ostaju relevantna za mnoge naučnike širom svijeta:

Hoće li naučnici koji rade na polju genske terapije moći razviti potpunu korekciju gena koja neće predstavljati prijetnju potomstvu?

Hoće li potreba i korist od postupka genske terapije za pojedinačni par nadmašiti rizik ove intervencije za budućnost čovječanstva?

Jesu li slične procedure opravdane s obzirom na budućnost?

Kako će se takvi postupci na osobi povezati s pitanjima homeostaze biosfere i društva?

U zaključku, može se primijetiti da genetska terapija u sadašnjoj fazi čovječanstvu nudi najviše načina za liječenje ozbiljne bolesti, koji su donedavno smatrani neizlječivim i fatalnim. Međutim, u isto vrijeme, razvoj ove nauke postavlja nove probleme naučnicima kojima se danas treba baviti.