Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια. Χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς, από την αρχαιολογία μέχρι τη γενετική.

Είναι η μέθοδος PCR που βοηθά στην καθιέρωση της πατρότητας, αλλά χρησιμοποιείται συχνότερα για τον εντοπισμό διαφόρων μολυσματικών ασθενειών στο ανθρώπινο σώμα.

Πώς γίνεται η ανάλυση PCR και τι είναι; Θα προσπαθήσουμε να απαντήσουμε σε αυτές τις ερωτήσεις λεπτομερώς.

Ανάλυση PCR - τι είναι;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος υψηλής ακρίβειας μοριακής γενετικής διάγνωσης που σας επιτρέπει να εντοπίσετε διάφορες μολυσματικές και κληρονομικές ασθένειες στον άνθρωπο, τόσο σε οξείες όσο και σε χρόνιο στάδιο, και πολύ πριν εκδηλωθεί η ασθένεια.

Η μέθοδος PCR είναι απολύτως συγκεκριμένη και, εάν εκτελεστεί σωστά, δεν μπορεί να δώσει ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Δηλαδή, αν δεν υπάρχει μόλυνση, τότε η ανάλυση δεν θα δείξει ποτέ ότι υπάρχει. Ως εκ τούτου, τώρα πολύ συχνά, για να επιβεβαιώσουν τη διάγνωση, κάνουν επιπλέον μια εξέταση PCR για να προσδιορίσουν το παθογόνο και τη φύση του.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αναπτύχθηκε το 1983 από τον Kary Mullis (ΗΠΑ), για την οποία του απονεμήθηκε το βραβείο βραβείο Νόμπελστον τομέα της χημείας.

Ποιο είναι το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου;

Η διάγνωση με αυτήν τη μέθοδο σάς επιτρέπει να βρείτε το παθογόνο απευθείας στο γονίδιο, το οποίο περιέχεται στα υπό μελέτη υλικά. Αυτή είναι η πιο ακριβής εξέταση για σεξουαλικά μεταδιδόμενες λοιμώξεις, κρυφές λοιμώξεις και διάφορα σεξουαλικά μεταδιδόμενα νοσήματα.

Διαφορές μεταξύ διαγνωστικών PCR και άλλων μεθόδων εργαστηριακής έρευναςέχουν ως εξής:

• η μέθοδος στοχεύει στον εντοπισμό του ίδιου του παθογόνου.
• Τα διαγνωστικά με τη χρήση της μεθόδου PCR διακρίνονται από την ευελιξία τους: για την ανίχνευση πολλών παθογόνων.
• ασθένειες, μόνο ένα βιολογικό δείγμα του ασθενούς είναι αρκετό.
• η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και δεν συνοδεύεται από άλλες διασταυρούμενες αντιδράσεις.

Επιπλέον, το πλεονέκτημα της διάγνωσης PCR είναι ότι οποιοδήποτε βιολογικό υλικό του ασθενούς είναι κατάλληλο για ανάλυση: αίμα, εκκρίσεις γεννητικών οργάνων, ούρα, σπέρμα.

Ποιες λοιμώξεις μπορεί να ανιχνεύσει ένα επίχρισμα PCR;

Μπορεί να υπάρχει μεγάλος αριθμός μολυσματικών παραγόντων στο σώμα, συμπεριλαμβανομένων των «κρυφών», οι οποίοι πολύς καιρόςΔεν δείχνουν καθόλου τον εαυτό τους.

Ανάλυση επιχρίσματος PCR σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε τέτοιες λοιμώξεις:

• ουρεπλάσμωση των γεννητικών οργάνων.
• καντιντίαση();
• έρπης;
• παρουσία καρκινικών κυττάρων.
• αξιολόγηση της ορμονικής κατάστασης.

Το υλικό δοκιμής για την PCR είναι συνήθως πτύελα, σάλιο, ούρα και αίμα. Πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης, πρέπει να προετοιμαστείτε προσεκτικά για αυτήν συμβουλευόμενοι πρώτα έναν γιατρό.

Το αίμα για PCR δίνεται συνήθως με άδειο στομάχι. Καλά αποτελέσματα εμφανίζονται με ανάλυση όταν το υλικό για έρευνα λαμβάνεται από τον αυχενικό σωλήνα ή την ουρήθρα. Σε αυτή την περίπτωση, είναι καλύτερο να πραγματοποιήσετε διάγνωση PCR το αργότερο μία ημέρα μετά τη σεξουαλική επαφή.

Τύποι PCR

Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς για δοκιμές και επιστημονικά πειράματα. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι ανάλυσης:

1. PCR αντίστροφης μεταγραφής(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - χρησιμοποιείται για την ενίσχυση, απομόνωση ή ταυτοποίηση μιας γνωστής αλληλουχίας από μια βιβλιοθήκη RNA.
2. Αντεστραμμένη PCR(Αντίστροφη PCR) - χρησιμοποιείται όταν είναι γνωστή μόνο μια μικρή περιοχή εντός της επιθυμητής αλληλουχίας. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν πρόκειται για τον προσδιορισμό γειτονικών αλληλουχιών μετά την εισαγωγή του DNA στο γονιδίωμα.
3. Η Nested PCR χρησιμοποιείται για τη μείωση του αριθμού των υποπροϊόντων της αντίδρασης. Χρησιμοποιούνται δύο ζεύγη εκκινητών και διεξάγονται δύο διαδοχικές αντιδράσεις.
4. Ασύμμετρη PCR(eng. Asymmetric PCR) - πραγματοποιείται όταν είναι απαραίτητο να ενισχυθεί κυρίως ένας από τους κλώνους του αρχικού DNA. Χρησιμοποιείται σε ορισμένες τεχνικές ανάλυσης αλληλουχίας και υβριδισμού.
5. Ποσοτική PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (Αγγλικά)) ή PCR σε πραγματικό χρόνο - χρησιμοποιείται για την άμεση παρακολούθηση της μέτρησης της ποσότητας ενός συγκεκριμένου προϊόντος PCR σε κάθε κύκλο αντίδρασης.
6. Βήμα προς βήμα PCR (Touchdown PCR) - χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, μειώνεται η επίδραση της μη ειδικής δέσμευσης εκκινητών.
7. Ειδική για την ομάδα PCR(eng. group-specific PCR) - PCR για σχετικές αλληλουχίες εντός ή μεταξύ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙχρησιμοποιώντας συντηρητικούς εκκινητές για αυτές τις αλληλουχίες.

Εάν η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του εκμαγείου είναι εν μέρει γνωστή ή καθόλου άγνωστη, μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκφυλισμένοι εκκινητές, η αλληλουχία των οποίων περιέχει εκφυλισμένες θέσεις στις οποίες μπορεί να εντοπιστεί οποιαδήποτε βάση. Για παράδειγμα, η αλληλουχία εκκινητών θα μπορούσε να είναι: ...ATH..., όπου Η είναι Α, Τ ή C.

Ποια βιολογικά υλικά μελετώνται;

Διάφορα βιολογικά μέσα και ανθρώπινα υγρά μπορούν να χρησιμεύσουν ως υλικό για την έρευνα PCR, στην οποία μπορεί να ανιχνευθεί ξένο βακτηριακό DNA ή ιικό DNA ή RNA:

1. Ούρο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μολυσματική βλάβητο ουρογεννητικό σύστημα στους άνδρες και τα ουροποιητικά όργανα στις γυναίκες (στους άνδρες, η χρήση ούρων ως υλικού αντικαθιστά την απόξεση του επιθηλίου).
2. Πτύελο. Χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της φυματίωσης και, σπανιότερα, για τη διάγνωση των αναπνευστικών μορφών χλαμυδίων και μυκοπλάσμωσης. Τα πτύελα σε ποσότητα 15-20 ml συλλέγονται σε αποστειρωμένη (μιας χρήσης) φιάλη.
3. Βιολογικά υγρά. Χυμός προστάτη, υπεζωκοτικό, νωτιαίο, αμνιακό υγρό, αρθρικό υγρό, βρογχοκυψελιδική πλύση, σάλιο συλλέγονται σύμφωνα με τις ενδείξεις.
4. Ξύσεις επιθηλίου από τους βλεννογόνους. Συνήθως χρησιμοποιείται για τη διάγνωση σεξουαλικά μεταδιδόμενων ασθενειών (ΣΜΝ), όπως γονόρροια, χλαμύδια, μυκοπλάσμωση, ουρεαπλάσμωση, τριχομονάση, γαρδνερέλλωση, έρπης και άλλες λοιμώξεις που επηρεάζουν τους βλεννογόνους.
5. Βιοψίες. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες γαστρικές βιοψίες είναι δωδεκαδάκτυλογια την ανίχνευση λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού.
6. Αίμα, πλάσμα, ορός. Χρησιμοποιείται για ανάλυση PCR της ηπατίτιδας B, C, D, G, έρπητα, CMV, ιών HIV και έρευνα ανθρώπινων γονιδίων.

Πώς να προετοιμαστείτε για τη δοκιμή;

Η αξιοπιστία του αποτελέσματος της PCR εξαρτάται άμεσα από τη σωστή υποβολή του υλικού για εξέταση. Το υλικό δεν πρέπει να είναι μολυσμένο, διαφορετικά το αποτέλεσμα της μελέτης δεν θα είναι αντικειμενικό. Οι πιο σημαντικές συστάσεις πριν από τη λήψη μιας δοκιμής PCR περιλαμβάνουν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

1. Τα ούρα συλλέγονται το πρωί σε αποστειρωμένο δοχείο.
2. Μια εξέταση αίματος για λοιμώξεις πρέπει να γίνεται με άδειο στομάχι το πρωί.
3. Δεν πρέπει να είστε σεξουαλικά ενεργοί την ημέρα πριν από την εξέταση.

Το αποτέλεσμα της ανάλυσης θα είναι έτοιμο 1,5-2 ημέρες μετά την εν λόγω διαδικασία. Υπάρχουν περιπτώσεις που το αποτέλεσμα μπορεί να προετοιμαστεί την ίδια μέρα.

Αποκωδικοποίηση της ανάλυσης OPC

Η διαδικασία ερμηνείας της παρουσιαζόμενης έρευνας διακρίνεται για την απλότητά της. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης PCR μπορούν να ληφθούν 1,5-2 ημέρες μετά την υποβολή του υλικού. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αποτέλεσμα είναι έτοιμο την πρώτη μέρα και να τι μπορεί να σημαίνουν:

• Αρνητικό αποτέλεσμαδείχνει ότι το διαγνωστικό υλικό δεν περιέχει τον επιθυμητό μολυσματικό παράγοντα.
• PCR θετικήσημαίνει ότι το DNA ή το RNA του παθογόνου είναι παρόν στο ανθρώπινο σώμα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις παράγουν ποσοτικοποίησημικροοργανισμών. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για ασθένειες που προκαλούνται από ευκαιριακούς μικροοργανισμούς. Δεδομένου ότι αυτά τα βακτήρια εμφανίζουν τις αρνητικές τους επιπτώσεις μόνο σε υπερβολικές ποσότητες.

Επίσης ποσοτική ανάλυσηΗ PCR είναι σημαντική για την επιλογή θεραπευτικών τακτικών και για την παρακολούθηση της θεραπείας ιογενών λοιμώξεων όπως οι ιοί HIV και ηπατίτιδας.

Πόσο ακριβής είναι η διάγνωση λοιμώξεων με PCR;

Η μέθοδος PCR χαρακτηρίζεται από υψηλή ακρίβεια, ειδικότητα και ευαισθησία. Αυτό σημαίνει ότι αυτή η ανάλυση είναι ικανή:

• να προσδιορίσει με ακρίβεια την παρουσία ή την απουσία μόλυνσης.
• υποδεικνύουν ακριβώς τι είδους μόλυνση είναι (ειδικότητα).
• ανίχνευση μόλυνσης ακόμη και με πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε μικροβιακό DNA βιολογικό υλικό,
• που δοκιμάστηκε (ευαισθησία).

Ανάλυση PCR: τιμή και χρονισμός

Η τιμή μιας συγκεκριμένης εξέτασης θα εξαρτηθεί από τη λοίμωξη για την οποία θα υποβληθείτε σε εξέταση. Κατά προσέγγιση τιμές και όροι:

1. STI: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
2. Ιός Epstein-Barr, ιός ανθρώπινων θηλωμάτων, έρπης, κυτταρομεγαλοϊός: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
3. Ηπατίτιδα A, B, C, D, G: ποιοτική ανάλυση 650 ρούβλια, ποσοτική ανάλυση 2000 ρούβλια. Όροι - έως 5 ημέρες.
4. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, συνολικά (Anti-HCV) – 420 ρούβλια.
5. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 ρούβλια.
6. Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού: 300-400 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
7. HIV (αντισώματα και αντιγόνα) - 380 ρούβλια.
8. HIV RNA, υψηλής ποιότητας – 3.500 ρούβλια.
9. HIV RNA, ποσοτικά – 11.000 ρούβλια.

Για να εξοικονομήσετε χρήματα, μπορείτε να επιλέξετε ένα σταθερό πακέτο ανάλυσης. Αυτή η υπηρεσία παρέχεται από τις περισσότερες κλινικές όπου μπορείτε να κάνετε εξετάσεις χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PRC (invitro, onclinic κ.λπ.).

Μεταξύ της μεγάλης ποικιλίας μεθόδων υβριδισμού για ανάλυση DNA, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται ευρύτερα στην κλινική εργαστηριακή διάγνωση.

Αρχή της μεθόδου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)(αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)) αναπτύχθηκε από τον Kary Mullis (Cetus, ΗΠΑ) το 1983. και σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως και για τα δύο επιστημονική έρευνα, και για διαγνωστικά στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη και την υπηρεσία Κρατικής Υγειονομικής και Επιδημιολογικής Εποπτείας (γονότυπος, διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων).

Στον πυρήνα Μέθοδος PCRβρίσκεται μια φυσική διαδικασία - συμπληρωματική ολοκλήρωση της μήτρας του DNA, που πραγματοποιείται με τη χρήση του ενζύμου DNA πολυμεράση. Αυτή η αντίδραση ονομάζεται Αντιγραφή DNA.

Η φυσική αντιγραφή του DNA περιλαμβάνει διάφορα στάδια:

1) Μετουσίωσης του DNA(ξετύλιξη της διπλής έλικας, απόκλιση κλώνων DNA).

2) Σχηματισμός βραχέων δικλωνικών τμημάτων DNA(απαραίτητοι εκκινητές για την έναρξη της σύνθεσης του DNA).

3) Σύνθεση νέου κλώνου DNA(συμπληρωματική ολοκλήρωση και των δύο νημάτων)

Αυτή η διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη λήψη αντιγράφων μικρές τομές DNA ειδικά για συγκεκριμένους μικροοργανισμούς,εκείνοι. πραγματοποιήσει μια στοχευμένη αναζήτηση για τέτοιες συγκεκριμένες περιοχές, που είναι ο στόχος της γονιδιακής διάγνωσης για τον εντοπισμό παθογόνων μολυσματικών ασθενειών.

Ανακάλυψη θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA (Taq polymerase) από θερμόφιλα βακτήρια Thermis aquaticus, το βέλτιστο του οποίου είναι στην περιοχή των 70-72°C, κατέστησε δυνατή τη κυκλική διαδικασία αντιγραφής του DNA και τη χρήση του για εργασία in vitro. Η δημιουργία προγραμματιζόμενων θερμοστατών (ενισχυτών), οι οποίοι, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, πραγματοποιούν κυκλικές αλλαγές θερμοκρασίας, δημιούργησαν τις προϋποθέσεις για την ευρεία εισαγωγή της μεθόδου PCR στην εργαστηριακή πρακτική. κλινική διάγνωση. Με πολλαπλές επαναλήψεις των κύκλων σύνθεσης, εμφανίζεται μια εκθετική αύξηση του αριθμού των αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA, η οποία καθιστά δυνατή τη λήψη επαρκούς αριθμού αντιγράφων DNA από μια μικρή ποσότητα αναλυόμενου υλικού, το οποίο μπορεί να περιέχει μεμονωμένα κύτταρα μικροοργανισμού, να τα αναγνωρίσουν με ηλεκτροφόρηση.

Η ολοκλήρωση της συμπληρωματικής αλυσίδας δεν ξεκινά σε κανένα σημείο της αλληλουχίας του DNA, αλλά μόνο σε ορισμένα αρχικά μπλοκ - κοντές δίκλωνες τομές. Με την προσάρτηση τέτοιων μπλοκ σε συγκεκριμένα τμήματα DNA, είναι δυνατό να κατευθύνεται η διαδικασία σύνθεσης μιας νέας αλυσίδας μόνο σε αυτό το τμήμα, και όχι σε όλο το μήκος της αλυσίδας του DNA. Για να δημιουργήσετε μπλοκ εκκίνησης στο καθορισμένες περιοχέςΤο DNA χρησιμοποιεί δύο ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές (20 ζεύγη νουκλεοτιδίων), που ονομάζονται αστάρια.Οι εκκινητές είναι συμπληρωματικοί με τις αλληλουχίες DNA στα αριστερά και δεξιά όρια ενός συγκεκριμένου θραύσματος και είναι προσανατολισμένοι με τέτοιο τρόπο ώστε η ολοκλήρωση μιας νέας αλυσίδας DNA να συμβαίνει μόνο μεταξύ τους.

Έτσι, η PCR είναι μια πολλαπλή αύξηση του αριθμού αντιγράφων (ενίσχυση) μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA που καταλύεται από το ένζυμο πολυμεράση DNA.

Για να πραγματοποιηθεί η ενίσχυση, απαιτούνται τα ακόλουθα εξαρτήματα:

Μίγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs)(ένα μείγμα τεσσάρων dNTPs, που αποτελούν το υλικό για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων DNA)

Ενζυμική πολυμεράση Taq(μια θερμοσταθερή πολυμεράση DNA που καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων εκκινητών προσθέτοντας διαδοχικά νουκλεοτιδικές βάσεις στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα του συντιθέμενου DNA).

Ρυθμιστικό διάλυμα(μέσο αντίδρασης που περιέχει ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη διατήρηση της ενζυμικής δραστηριότητας)
Για τον εντοπισμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος των ιών RNA, ένα αντίγραφο DNA λαμβάνεται πρώτα από ένα πρότυπο RNA χρησιμοποιώντας μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) που καταλύεται από το ένζυμο ρεβερτάση (αντίστροφη μεταγραφάση).

Για να ληφθεί επαρκής αριθμός αντιγράφων του επιθυμητού χαρακτηριστικού θραύσματος DNA, η ενίσχυση περιλαμβάνει αρκετούς (20-40) κύκλους.

Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλαμβάνει 3 στάδια που συμβαίνουν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας Στάδιο 1: μετουσίωση DNA(ξεπλέξιμο της διπλής έλικας). Εμφανίζεται στους 93-95°C για 30-40 δευτερόλεπτα. Στάδιο 2: Προσάρτηση ασταριών (ανόπτηση).Η ένωση των εκκινητών συμβαίνει συμπληρωματικά προς τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε αντίθετους κλώνους DNA στα όρια μιας συγκεκριμένης περιοχής. Κάθε ζεύγος ασταριών έχει τη δική του θερμοκρασία ανόπτησης, οι τιμές της οποίας είναι στην περιοχή 50-65°C. Χρόνος ανόπτησης -20-60 sec. Στάδιο 3: Ολοκλήρωση αλυσίδων DNA.Συμπληρωματική προσθήκη κλώνων DNA λαμβάνει χώρα από το 5'-άκρο στο 3'-άκρο της αλυσίδας σε αντίθετες κατευθύνσεις, ξεκινώντας από τις θέσεις προσάρτησης του εκκινητή. Το υλικό για τη σύνθεση νέων αλυσίδων DNA είναι τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dNTPs) που προστίθενται στο διάλυμα. Η διαδικασία σύνθεσης καταλύεται από το ένζυμο θερμοσταθερή DNA πολυμεράση (Taq polymerase) και λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία 70-72°C. Ο χρόνος σύνθεσης είναι 20-40 δευτερόλεπτα.

Οι νέες αλυσίδες DNA που σχηματίζονται στον πρώτο κύκλο ενίσχυσης χρησιμεύουν ως πρότυπα για τον δεύτερο κύκλο ενίσχυσης, στον οποίο σχηματίζεται το επιθυμητό ειδικό θραύσμα DNA (amplicon). (βλ. Εικ. 2). Στους επόμενους κύκλους ενίσχυσης, τα αμπλικόνια χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων αλυσίδων. Έτσι, τα αμπλικόνια συσσωρεύονται σε διάλυμα σύμφωνα με τον τύπο 2n, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης. Επομένως, ακόμα κι αν το αρχικό διάλυμα περιείχε αρχικά μόνο ένα δίκλωνο μόριο DNA, τότε σε 30-40 κύκλους περίπου 108 μόρια αμπλικονίου συσσωρεύονται στο διάλυμα. Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για αξιόπιστη οπτική ανίχνευση αυτού του θραύσματος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η διαδικασία ενίσχυσης πραγματοποιείται σε ειδικό προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή), ο οποίος, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες ανάλογα με τον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης.

ΣΤΑΔΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ PCR

Η μέθοδος PCR, ως εργαλείο εργαστηριακής διάγνωσης μολυσματικών ασθενειών, βασίζεται στην ανίχνευση ενός μικρού θραύσματος DNA του παθογόνου (πολλές εκατοντάδες ζεύγη βάσεων), ειδικού μόνο για έναν δεδομένο μικροοργανισμό, χρησιμοποιώντας μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τη συσσώρευση του επιθυμητού θραύσμα.
Η μέθοδος ανάλυσης με τη μέθοδο PCR περιλαμβάνει τρία στάδια:

1. Απομόνωση DNA (RNA) από κλινικό δείγμα

Απομόνωση DNA (RNA).
Σε αυτό το στάδιο της ανάλυσης, το κλινικό δείγμα υποβάλλεται σε ειδική επεξεργασία, με αποτέλεσμα τη λύση του κυτταρικού υλικού, την απομάκρυνση των πρωτεϊνών και των κλασμάτων πολυσακχαρίτη και τη λήψη ενός διαλύματος DNA ή RNA απαλλαγμένου από
αναστολείς και έτοιμο για περαιτέρω ενίσχυση.
Η επιλογή της τεχνικής απομόνωσης DNA (RNA) καθορίζεται κυρίως από τη φύση του κλινικού υλικού που υποβάλλεται σε επεξεργασία.

Ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA
Σε αυτό το στάδιο, μικρά ειδικά θραύσματα DNA συσσωρεύονται στην ποσότητα που απαιτείται για την περαιτέρω ανίχνευσή τους. Οι περισσότερες μέθοδοι για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων θραυσμάτων γονιδιώματος χρησιμοποιούν το λεγόμενο. " κλασική έκδοσηκατευθυνόμενη PCR. Για να αυξηθεί η ειδικότητα και η ευαισθησία της ανάλυσης, ορισμένες μέθοδοι χρησιμοποιούν τη μέθοδο "φωλιασμένη" PCR, η οποία χρησιμοποιεί 2 ζεύγη εκκινητών ("εξωτερικό" - για το στάδιο 1 και "εσωτερικό" - για το στάδιο 2).

Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης
Στις περισσότερες μεθόδους, σε αυτό το στάδιο, το μείγμα των προϊόντων ενίσχυσης που λαμβάνεται στο 2ο στάδιο διαχωρίζεται με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Πριν από τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό, ένα διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου προστίθεται στο μείγμα ενίσχυσης, το οποίο σχηματίζει ισχυρές ενδιάμεσες ενώσεις με δίκλωνα θραύσματα DNA. Αυτές οι ενώσεις είναι ικανές να φθορίζουν υπό ακτινοβολία UV, η οποία καταγράφεται με τη μορφή πορτοκαλοκόκκινων φωτεινών ζωνών μετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό του μίγματος ενίσχυσης σε πήκτωμα αγαρόζης.

Ως εναλλακτική της μεθόδου ηλεκτροφορητικής ανίχνευσης, η οποία έχει ορισμένα μειονεκτήματα: υποκειμενικότητα στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων, περιορισμοί στον προσδιορισμό του DNA διαφόρων μικροοργανισμών σε μία αντίδραση, μπορεί να προταθεί. σχήματα ανίχνευσης υβριδισμού.Σε αυτά τα σχήματα, το θραύσμα DNA που σχηματίζεται ως αποτέλεσμα της ενίσχυσης υβριδοποιείται (σχηματίζει 2κλωνα σύμπλοκα - "υβρίδια") με έναν ειδικό ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή. Η καταχώριση τέτοιων συμπλεγμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρωματομετρικά ή φθοριομετρικά. Το SPF "Litekh" δημιούργησε κιτ ανίχνευσης που βασίζονται σε υβριδισμό με φθορισμομετρική καταχώρηση αποτελεσμάτων

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR ως μέθοδος για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών:

- Άμεσος προσδιορισμός της παρουσίας παθογόνων

Πολλές παραδοσιακές διαγνωστικές μέθοδοι, όπως η ενζυμική ανοσοδοκιμασία, προσδιορίζουν πρωτεΐνες-δείκτες που είναι απόβλητα μολυσματικών παραγόντων, γεγονός που παρέχει μόνο έμμεσες ενδείξεις για την παρουσία μόλυνσης. Η αναγνώριση ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA του παθογόνου με PCR δίνει μια άμεση ένδειξη της παρουσίας του μολυσματικού παράγοντα.

- Υψηλή ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων ανάλυσης
Η ανάλυση PCR δεν απαιτεί απομόνωση και ανάπτυξη καλλιέργειας του παθογόνου, η οποία απαιτεί πολύ χρόνο. Μια ενοποιημένη μέθοδος για την επεξεργασία βιοϋλικών και την ανίχνευση προϊόντων αντίδρασης και η αυτοματοποίηση της διαδικασίας ενίσχυσης καθιστούν δυνατή την πραγματοποίηση πλήρης ανάλυσησε 4-4,5 ώρες.

Πρέπει να σημειωθεί ότι η μέθοδος PCR μπορεί να ανιχνεύσει παθογόνα όχι μόνο σε κλινικό υλικό που λαμβάνεται από έναν ασθενή, αλλά και σε υλικό που λαμβάνεται από περιβαλλοντικά αντικείμενα (νερό, έδαφος κ.λπ.).

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR ΣΤΗΝ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙΔΑ ΥΓΕΙΑΣ

Η χρήση της μεθόδου PCR για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών τόσο βακτηριακής όσο και ιογενούς φύσης είναι τεράστιας σημασίας για την επίλυση πολλών προβλημάτων μικροβιολογίας και επιδημιολογίας. Η χρήση αυτής της μεθόδου συμβάλλει επίσης στην ανάπτυξη βασική έρευναστον τομέα της μελέτης των χρόνιων και ελάχιστα κατανοητών λοιμωδών νοσημάτων.

Η πιο αποτελεσματική και οικονομικά εφικτή χρήση της μεθόδου είναι:

ουρογυναικολογική πρακτική- για την ανίχνευση χλαμυδίων, ουρεαπλάσμωσης, γονόρροιας, έρπητα, γαρδνερέλλωσης, μόλυνσης από μυκόπλασμα.

στην πνευμονολογία- Για διαφορική διάγνωσηιογενής και βακτηριακή πνευμονία, φυματίωση.

στη γαστρεντερολογία- για τον εντοπισμό της ελικοβακτηρίωσης.

στο λοιμωξιολογικό ιατρείο- ως εξπρές μέθοδος για τη διάγνωση σαλμονέλωσης, διφθερίτιδας, ιογενούς ηπατίτιδα Β, Cκαι G;

στην αιματολογία- να αναγνωρίσει λοίμωξη από κυτταρομεγαλοϊόογκοϊούς.

Η διεξαγωγή της ανάλυσης PCR (PCR diagnostics) ξεκινά με τη συλλογή υλικού για εξέταση από γυναικολόγο, ουρολόγο ή δερματοφλεβολόγο. Η ποιότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν στη συνέχεια διασφαλίζεται από τα υψηλότερα προσόντα και την τεράστια εμπειρία των γιατρών του ιατρικού κέντρου Euromedprestige, οι οποίοι συμμορφώνονται με όλους τους απαραίτητους κανόνες για τη διεξαγωγή ανάλυσης PCR: πλήρης στειρότητα, χρήση μόνο υλικών μιας χρήσης.

Το υλικό που συλλέγεται από τη βούρτσα τοποθετείται σε δοχείο με αλατούχο διάλυμα. Μετά τη συλλογή, τα δείγματα πρέπει να παραδοθούν στο εργαστήριο PCR το συντομότερο δυνατό.

Η ανάλυση PCR πραγματοποιείται στο εργαστήριο σε τρία στάδια:

1. Εξαγωγή DNA
2. Ενίσχυση θραυσμάτων DNA
3. Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης DNA

Η εξαγωγή DNA είναι το αρχικό στάδιο της διάγνωσης PCR, η ουσία της οποίας είναι η εξής: ο γιατρός παίρνει υλικό για έρευνα από τον ασθενή και το υποβάλλει σε ειδική επεξεργασία. Κατά την επεξεργασία, η διπλή έλικα του DNA χωρίζεται σε μεμονωμένους κλώνους. Ένα ειδικό υγρό προστίθεται στο υλικό του ασθενούς για να διαλυθεί οργανική ύλη, παρεμποδίζοντας την «καθαρότητα» της αντίδρασης. Αυτό αφαιρεί λιπίδια, αμινοξέα, πεπτίδια, υδατάνθρακες, πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται DNA ή RNA.

Η αρχή της μεθόδου PCR είναι η «κατασκευή» νέων μολύνσεων από DNA ή RNA. Αυτό δεν μπορεί να γίνει χωρίς την αφαίρεση του κυψελωτού υλικού.

Ο χρόνος που δαπανάται για την εξαγωγή DNA εξαρτάται από τον αιτιολογικό παράγοντα της μόλυνσης και από τον τύπο του υλικού που χρησιμοποιείται για την έρευνα PCR. Για παράδειγμα, χρειάζονται 1,5-2 ώρες για να προετοιμαστεί το αίμα για το επόμενο στάδιο.

0Πίνακας ( => Αναλύει) Πίνακας ( => 2) Πίνακας ( =>.html) 2

Ενίσχυση DNA

Για να πραγματοποιήσουν το επόμενο στάδιο της διάγνωσης του DNA - την ενίσχυση του DNA - οι γιατροί χρησιμοποιούν τις λεγόμενες μήτρες DNA - μόρια DNA λοιμώξεων, στα οποία στη συνέχεια θα συμβεί "κλωνοποίηση" DNA. Έχει ήδη αναφερθεί ότι η παρουσία του πλήρους DNA της μόλυνσης δεν είναι απαραίτητη· για να πραγματοποιηθεί αυτό το στάδιο, αρκεί ένα μικρό κομμάτι του μορίου DNA, το οποίο είναι χαρακτηριστικό μόνο ενός δεδομένου μικροβίου (μόλυνση).

Η βάση της ενίσχυσης του DNA και, κατά συνέπεια, η βάση ολόκληρης της αρχής της αντίδρασης PCR είναι η φυσική διαδικασία ολοκλήρωσης του DNA για όλα τα ζωντανά όντα - η αντιγραφή του DNA, η οποία πραγματοποιείται με διπλασιασμό μιας μοναδικής αλυσίδας DNA.

Ξεκινώντας με ένα μόνο θραύσμα DNA, ο εργαστηριακός ιατρός το αντιγράφει και αυξάνει τον αριθμό των αντιγράφων σε λειτουργία αλυσιδωτής αντίδρασης: μετά τον πρώτο κύκλο έχετε ήδη 2 θραύσματα, μετά τον δεύτερο κύκλο - 4, μετά τον τρίτο - 8, μετά το τέταρτο - 16, μετά 32 , 64, 128, 256... Με κάθε κύκλο ο αριθμός των αντιγράφων διπλασιάζεται και μετά από είκοσι κύκλους η καταμέτρηση πηγαίνει ήδη σε εκατομμύρια, και μετά από τριάντα - σε δισεκατομμύρια. Ο κύκλος διαρκεί λίγα λεπτά και καταλήγει σε μια ορισμένη αλλαγή της θερμοκρασίας σε έναν πολύ μικρό χημικό αντιδραστήρα. Εδώ, στο διάλυμα, όλα τα απαραίτητα συστατικά της σύνθεσης είναι παρόντα σε επαρκείς ποσότητες, πρώτα απ 'όλα, τα νουκλεοτίδια A, G, T και C, και επίσης εκτελούνται ευαίσθητες προπαρασκευαστικές χημικές εργασίες έτσι ώστε να λαμβάνεται αμέσως ένα ακριβές αντίγραφο από κάθε ολοκληρωμένο τμήμα DNA, μετά από αυτό το αντίγραφο - πάλι ένα αντίγραφο, αυτή είναι η αντίδραση διακλαδισμένης αλυσίδας.

Με την προσάρτηση εκκινητών στην αλυσίδα DNA - τεχνητά συντιθέμενα «κομμάτια» DNA (ζεύγη νουκλεοτιδίων) παρόμοια με το DNA των μικροβίων (λοιμώξεις) - σχηματίζονται δύο σύντομες έλικες που αποτελούνται από δύο κλώνους τμημάτων DNA, οι οποίες είναι απαραίτητες για τη σύνθεση του μέλλοντος DNA.

Η σύνθεση μιας νέας αλυσίδας λαμβάνει χώρα με την ολοκλήρωση καθενός από τους δύο κλώνους DNA. Η διαδικασία ενίσχυσης συμβαίνει με τη βοήθεια μιας συγκεκριμένης περιοχής - DNA πολυμεράσης, η οποία δίνει το όνομά της εργαστηριακή μέθοδο. Η πολυμεράση δρα ως καταλύτης για την αντίδραση και παρακολουθεί τη διαδοχική σύνδεση των βάσεων νουκλεοτιδίου στον αναπτυσσόμενο νέο κλώνο DNA.

Έτσι, η ενίσχυση του DNA είναι μια πολλαπλή αύξηση του αριθμού των αντιγράφων DNA που είναι ειδικά, δηλ. εγγενή μόνο σε έναν συγκεκριμένο οργανισμό. Δεν χρειάζεται να συμπληρώσετε ολόκληρη την αλυσίδα DNA για να δείτε τον μολυσματικό παράγοντα. Χρειάζεται μόνο η περιοχή που είναι χαρακτηριστική για ένα δεδομένο βακτήριο ως άτομο.

5360 τρίψτε. Κόστος ολοκληρωμένου προγράμματος με γαστρεντερολόγο

ΕΚΠΤΩΣΗ 25% ΣΕ ΡΑΝΤΕΒΟΥ ΜΕ ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΟ

- 25%πρωταρχικός
Επίσκεψη γιατρού
θεραπευτής τα Σαββατοκύριακα

5.160 RUB αντί για 5.420 τρίψτε. Έλεγχος ανδρών για ουρολογικές λοιμώξεις

ΑΛΛΕΡΓΟΛΟΓΙΑ 5.120 RUB αντί για 5.590 τρίψτε.

Όλα τα εξαιρετικά επαναλαμβανόμενα βήματα ενίσχυσης συμβαίνουν σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Για τη διεξαγωγή ανάλυσης PCR, χρησιμοποιείται ειδικά προγραμματιζόμενος εξοπλισμός - PCR - θερμοστάτης ή ενισχυτής, ο οποίος αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες. Η ενίσχυση πραγματοποιείται σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα που αντιστοιχεί στον τύπο της μόλυνσης που ανιχνεύεται. Ανάλογα με το πρόγραμμα και τον τύπο της μόλυνσης που ανιχνεύεται, η αυτοματοποιημένη διαδικασία PCR διαρκεί από 2 έως 3 ώρες.

Τα προσόντα του εργαστηριακού γιατρού που εκτελεί την ανάλυση παίζουν σημαντικό ρόλο στη διάγνωση PCR· οι σωστές ρυθμίσεις του εξοπλισμού PCR και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων εξαρτώνται από αυτόν. Οι γιατροί στο Ιατρικό Κέντρο Euromedprestige έχουν εκτενή εμπειρία στη διεξαγωγή διαγνωστικών DNA, γεγονός που διασφαλίζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της έρευνας και εγγυάται θετική επιτυχία στη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών. Να κάνουμε εξετάσεις PCR και να κάνουμε πλήρη διάγνωση και θεραπεία μολυσματικών ασθενειών στο δικό μας ιατρικό Κέντρο«Euromedprestige».

Κατά την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης, το προκύπτον μείγμα προϊόντων ενίσχυσης διαχωρίζεται. Στο μείγμα προστίθενται ειδικά διαλύματα, τα οποία δίνουν στα θραύσματα DNA την ικανότητα να φθορίζουν - αντανακλώνται σε πορτοκαλοκόκκινες φωτεινές λωρίδες. Η λάμψη που προκύπτει υποδηλώνει την παρουσία DNA ιών, μικροβίων ή βακτηρίων στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή για ανάλυση PCR.

Αρχές διάγνωσης PCR

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

ενότητες, 34 σελίδες, 5 σχήματα, 5 αναφορές

Ο σκοπός αυτής της εργασίας είναι περίληψηβασικές αρχές και τεχνολογικά χαρακτηριστικά της μεθόδου PCR, τα επιστημονικά και Πρακτική εφαρμογηστη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΥΜΒΑΤΙΚΩΝ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ

HCV - ιός ηπατίτιδας C

dATP - τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη

dGTP - τριφωσφορική δεοξυγουανοσίνη

dNTP - τριφωσφορικό δεοξυνουκλεοτίδιο

dTTP - τριφωσφορική δεοξυθυμιδίνη

dCTP - τριφωσφορική δεοξυκυτοσίνη

DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ

PCR - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

RNA - ριβονουκλεϊκό οξύ - κατηγορία ανοσοσφαιρίνης GTime PCR - μέθοδος PCR σε πραγματικό χρόνο

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

ΣΤΑΔΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ PCR

ΜΕΘΟΔΟΣ PCR σε πραγματικό χρόνο

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΑΝΑΦΟΡΩΝ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η ανακάλυψη της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) έχει γίνει μια από τις πιο αξιοσημείωτες εξελίξεις στον τομέα της μοριακής βιολογίας τις τελευταίες δεκαετίες. Αυτό κατέστησε δυνατή την αύξηση ιατρική διάγνωσησε βάση υψηλής ποιότητας νέο επίπεδο. Η αρχή της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αναπτύχθηκε από την Carrie Mullis το 1983. Για την ανάπτυξη της ανάλυσης PCR, ο K. Mullis τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993.

Μετά την ανακάλυψη της PCR, πολύ γρήγορα εισήχθη στην πράξη. Η μέθοδος έχει γίνει τόσο δημοφιλής που σήμερα είναι δύσκολο να φανταστεί κανείς την εργασία στον τομέα της μοριακής βιολογίας χωρίς τη χρήση της. Η μέθοδος PCR έχει αναπτυχθεί ιδιαίτερα γρήγορα χάρη στο διεθνές πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος. Έχουν δημιουργηθεί σύγχρονες τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας με λέιζερ (αποκωδικοποίηση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων DNA). Αν στο πρόσφατο παρελθόν χρειαζόταν μια εβδομάδα για να αποκρυπτογραφηθεί μια αλληλουχία DNA 250 ζευγών νουκλεοτιδίων (bp), οι σύγχρονοι μηχανισμοί αλληλουχίας λέιζερ μπορούν να προσδιορίσουν έως και 5000 bp. σε μια μέρα. Αυτό με τη σειρά του συμβάλλει στη σημαντική ανάπτυξη βάσεων δεδομένων πληροφοριών που περιέχουν αλληλουχίες DNA. Επί του παρόντος, έχουν προταθεί διάφορες τροποποιήσεις της PCR, έχει αποδειχθεί η δυνατότητα δημιουργίας δοκιμαστικών συστημάτων για την ανίχνευση μικροοργανισμών και τον εντοπισμό σημειακών μεταλλάξεων, δεκάδες πιθανές εφαρμογέςμέθοδος.

Η εμφάνιση της μεθόδου PCR οφείλεται σε ορισμένα επιτεύγματα στον τομέα της μοριακής γενετικής, κυρίως στην αποκωδικοποίηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδιωμάτων ενός αριθμού μικροοργανισμών. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ανακάλυψη αυτή συνοδεύτηκε από την ανάπτυξη ορισμένων τεχνολογιών. Συγκεκριμένα, η εμφάνιση συσκευών που καθιστούν δυνατή την αυτόματη σύνθεση μονόκλωνων θραυσμάτων DNA (ολιγονουκλεοτίδια). Την ίδια περίοδο ανακαλύφθηκαν μοναδικοί μικροοργανισμοί που ζουν σε γκέιζερ. Το ενζυματικό τους σύστημα, ιδιαίτερα η DNA πολυμεράση, αντέχει στις υψηλές θερμοκρασίες των θερμών πηγών και διατηρεί τη βιολογική του δράση μέχρι τους 95°C, που είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την πραγματοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι σήμερα η πιο προηγμένη διαγνωστική μέθοδος της μοριακής βιολογίας, της μοριακής γενετικής και της κλινικής εργαστηριακής διάγνωσης, που επιτρέπει την ανίχνευση σε ιστούς και βιολογικά υγράοργανισμός μονοκύτταρα παθογόνων πολλών μολυσματικών ασθενειών.

Η μέθοδος PCR βασίζεται στη συμπληρωματική ολοκλήρωση ενός τμήματος γονιδιωματικού DNA ή RNA του παθογόνου, που πραγματοποιείται in vitro χρησιμοποιώντας το ένζυμο θερμοσταθερή DNA πολυμεράση. Η ειδικότητα της μεθόδου καθορίζεται από τη μοναδικότητα του γενετικού υλικού των ανιχνευόμενων μολυσματικών παραγόντων, στα οποία επιλέγονται οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές που εμπλέκονται στη διαδικασία ενίσχυσης.

Διάγνωση μολυσματικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων αυτών που προκαλούνται από δύσκολα καλλιεργήσιμους παράγοντες, γονότυπος μικροοργανισμών, αξιολόγηση της λοιμογόνου δράσης τους, προσδιορισμός αντοχής της μικροχλωρίδας στα αντιβιοτικά, προγεννητική διάγνωση, βιολογική παρακολούθηση των προϊόντων αίματος - αυτός είναι ένας ελλιπής κατάλογος τομέων της ιατρικής χρησιμοποιώντας PCR. Σήμερα, η ανάλυση PCR παραμένει η πιο διαδεδομένη και δυναμικά αναπτυσσόμενη τεχνολογία. Κάθε χρόνο, εμφανίζονται στην αγορά δεκάδες νέα συστήματα δοκιμών για ανάλυση PCR, σχεδιασμένα τόσο για τον εντοπισμό των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων διαφόρων μικροοργανισμών που προκαλούν ασθένειες όσο και για τη μελέτη των ανθρώπινων γονιδίων. Το κόστος της ανάλυσης PCR μειώνεται σταθερά, γεγονός που συμβάλλει στην ολοένα και πιο διαδεδομένη χρήση της μεθόδου σε ιατρικά και διαγνωστικά ιδρύματα. Ο αριθμός των εργαστηρίων PCR στις χώρες της ΚΑΚ αυξάνεται εκθετικά και, προφανώς, στο εγγύς μέλλον η ανάλυση PCR θα γίνει μια από τις πιο κοινές εργαστηριακές διαγνωστικές μεθόδους.

1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια μέθοδος που μιμείται τη φυσική αντιγραφή του DNA και επιτρέπει την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου μορίου DNA παρουσία εκατομμυρίων άλλων μορίων.

Η ουσία της μεθόδου είναι η επανειλημμένη αντιγραφή (ενίσχυση) ορισμένων τμημάτων DNA σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενων κύκλων θερμοκρασίας. Σε κάθε κύκλο ενίσχυσης, τα θραύσματα που είχαν συντεθεί προηγουμένως αντιγράφονται και πάλι από πολυμεράση DNA. Λόγω αυτού, υπάρχει πολλαπλή αύξηση στον αριθμό των συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA, γεγονός που απλοποιεί σημαντικά την περαιτέρω ανάλυση.

Η μέθοδος PCR βασίζεται σε μια φυσική διαδικασία - συμπληρωματική ολοκλήρωση της μήτρας του DNA, που πραγματοποιείται με τη χρήση του ενζύμου DNA πολυμεράση. Αυτή η αντίδραση ονομάζεται αντιγραφή DNA.

Η φυσική αντιγραφή του DNA περιλαμβάνει διάφορα στάδια:

) μετουσίωση DNA (ξετύλιξη της διπλής έλικας, απόκλιση κλώνων DNA).

) Σχηματισμός βραχέων δικλωνικών τμημάτων DNA (απαραίτητες εκκινητές για την έναρξη της σύνθεσης DNA).

) Σύνθεση νέου κλώνου DNA (συμπληρωματική ολοκλήρωση και των δύο κλώνων).

Αυτή η διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή αντιγράφων μικρών τμημάτων DNA που είναι ειδικά για συγκεκριμένους μικροοργανισμούς, π.χ. πραγματοποιήσει μια στοχευμένη αναζήτηση για τέτοιες συγκεκριμένες περιοχές, που είναι ο στόχος της γονιδιακής διάγνωσης για τον εντοπισμό παθογόνων μολυσματικών ασθενειών.

Ανακάλυψη θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA (Taq polymerase) από θερμόφιλα βακτήρια Thermisaquaticus, το βέλτιστο του οποίου είναι στην περιοχή των 70-72°C, κατέστησε δυνατή τη κυκλική διαδικασία αντιγραφής του DNA και τη χρήση του για εργασία in vitro. Η δημιουργία προγραμματιζόμενων θερμοστατών (ενισχυτών), που πραγματοποιούν κυκλικές αλλαγές θερμοκρασίας σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, έχει δημιουργήσει τις προϋποθέσεις για την ευρεία εισαγωγή της μεθόδου PCR στην πρακτική της εργαστηριακής κλινικής διάγνωσης. Με πολλαπλές επαναλήψεις κύκλων σύνθεσης, εμφανίζεται μια εκθετική αύξηση του αριθμού των αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA, γεγονός που καθιστά δυνατή τη λήψη επαρκούς αριθμού αντιγράφων DNA για την αναγνώρισή τους από μια μικρή ποσότητα αναλυόμενου υλικού, το οποίο μπορεί να περιέχει μεμονωμένα κύτταρα των μικροοργανισμών.

Η ολοκλήρωση της συμπληρωματικής αλυσίδας δεν ξεκινά σε κανένα σημείο της αλληλουχίας του DNA, αλλά μόνο σε ορισμένα αρχικά μπλοκ - κοντές δίκλωνες τομές. Με την προσάρτηση τέτοιων μπλοκ σε συγκεκριμένα τμήματα DNA, είναι δυνατό να κατευθύνεται η διαδικασία σύνθεσης μιας νέας αλυσίδας μόνο σε αυτό το τμήμα, και όχι σε όλο το μήκος της αλυσίδας του DNA. Για τη δημιουργία μπλοκ έναρξης σε δεδομένες τομές DNA, χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (20 ζεύγη νουκλεοτιδίων), που ονομάζονται εκκινητές. Οι εκκινητές είναι συμπληρωματικοί με τις αλληλουχίες DNA στα αριστερά και δεξιά όρια ενός συγκεκριμένου θραύσματος και είναι προσανατολισμένοι με τέτοιο τρόπο ώστε η ολοκλήρωση μιας νέας αλυσίδας DNA να συμβαίνει μόνο μεταξύ τους.

Έτσι, η PCR είναι μια πολλαπλή αύξηση του αριθμού αντιγράφων (ενίσχυση) μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA που καταλύεται από το ένζυμο πολυμεράση DNA.

. ΣΤΑΔΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ PCR

Η μέθοδος ανάλυσης με τη μέθοδο PCR περιλαμβάνει τρία στάδια:

1. Απομόνωση DNA (RNA) από κλινικό δείγμα.

2. Ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA.

. Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης.

. Απομόνωση DNA (RNA).

Σε αυτό το στάδιο της ανάλυσης, το κλινικό δείγμα υποβάλλεται σε ειδική επεξεργασία, ως αποτέλεσμα της οποίας λύεται το κυτταρικό υλικό, αφαιρούνται τα κλάσματα πρωτεΐνης και πολυσακχαρίτη και λαμβάνεται ένα διάλυμα DNA ή RNA, απαλλαγμένο από αναστολείς και έτοιμο για περαιτέρω ενίσχυση. Η επιλογή της τεχνικής εξαγωγής DNA (RNA) καθορίζεται κυρίως από τη φύση του κλινικού υλικού που υποβάλλεται σε επεξεργασία.

2.Ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA

Σε αυτό το στάδιο, μικρά ειδικά θραύσματα DNA συσσωρεύονται στην ποσότητα που απαιτείται για την περαιτέρω ανίχνευσή τους.

Για να πραγματοποιηθεί μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, πρέπει να υπάρχουν ορισμένα συστατικά στο μείγμα αντίδρασης:

· Primers- τεχνητά συντιθέμενα ολιγονουκλεοτίδια, που συνήθως κυμαίνονται σε μέγεθος από 15 έως 30 bp, πανομοιότυπα με τα αντίστοιχα τμήματα του DNA στόχου. Παίζουν βασικό ρόλο στο σχηματισμό προϊόντων αντίδρασης ενίσχυσης. Τα σωστά επιλεγμένα αστάρια διασφαλίζουν την ειδικότητα και την ευαισθησία του συστήματος δοκιμής.

· Taq πολυμεράση- θερμοσταθερό ένζυμο που εξασφαλίζει την ολοκλήρωση του 3 - το άκρο του δεύτερου κλώνου DNA σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας.

· Μίγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs)- Τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη (dATP), τριφωσφορική δεοξυγουανοσίνη (dGTP), τριφωσφορική δεοξυκυτοσίνη (dCTP) και τριφωσφορική δεοξυθυμιδίνη (dTTP) - το «δομικό υλικό» που χρησιμοποιείται από την πολυμεράση Taq για τη σύνθεση του δεύτερου κλώνου του DNA.

· Buffer -ένα μείγμα κατιόντων και ανιόντων σε μια ορισμένη συγκέντρωση, παρέχοντας βέλτιστες συνθήκες για την αντίδραση, καθώς και μια σταθερή τιμή pH.

· Αναλυθέν δείγμα- ένα παρασκεύασμα που παρασκευάζεται για προσθήκη στο μίγμα της αντίδρασης, το οποίο μπορεί να περιέχει το επιθυμητό DNA, για παράδειγμα, το DNA των μικροοργανισμών, το οποίο χρησιμεύει ως στόχος για επακόλουθη επαναλαμβανόμενη αντιγραφή.

Εικ.1 Συστατικά του μίγματος αντίδρασης

Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλαμβάνει 3 στάδια που συμβαίνουν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας:

Στάδιο 1:Μετουσίωσης του DNA (ξεπλέξιμο της διπλής έλικας). Εμφανίζεται στους 93-95°C για 30-40 δευτερόλεπτα.

Ένα από τα κυκλώματα (+) χρησιμοποιείται ως κύριος πίνακας. Τα άκρα των πέντε ράβδων του στερεώνονται από το ένζυμο πολυμεράση DNA, το οποίο εξασφαλίζει την κατασκευή ενός δεύτερου κλώνου DNA, συμπληρωματικού του πρώτου, από μεμονωμένα νουκλεοτίδια. Το ίδιο, μόνο προς την αντίθετη κατεύθυνση, συμβαίνει στον δεύτερο κλώνο του DNA, ωστόσο, καθώς το ξετύλιγμα του μορίου του DNA προχωρά με την αντίστροφη σειρά, ο νέος κλώνος χτίζεται σε μικρά θραύσματα, τα οποία στη συνέχεια συρράπτονται μεταξύ τους. Προκειμένου το ένζυμο πολυμεράσης DNA να ξεκινήσει τη δουλειά του, απαιτείται η παρουσία ενός σπόρου ή ενός εκκινητή - ένα μικρό μονόκλωνο θραύσμα DNA, το οποίο, όταν συνδέεται με τη συμπληρωματική περιοχή ενός από τους μητρικούς κλώνους DNA, σχηματίζει ένα αρχικό μπλοκ για την ανάπτυξη της κόρης.

Στάδιο 2:Προσάρτηση ασταριών (ανόπτηση). Η προσκόλληση των εκκινητών συμβαίνει συμπληρωματικά προς τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε αντίθετους κλώνους DNA στα όρια μιας συγκεκριμένης περιοχής. Κάθε ζεύγος ασταριών έχει τη δική του θερμοκρασία ανόπτησης, οι τιμές της οποίας είναι στην περιοχή 50-65°C. Η ακριβής υπολογισμένη και πειραματικά επαληθευμένη θερμοκρασία ανόπτησης εκκινητών είναι ένα από τα χαρακτηριστικά που καθορίζουν την ειδικότητα της αντίδρασης, εξαιρουμένης της προσάρτησης εκκινητών σε ατελώς συμπληρωματικές αλληλουχίες.

Δεδομένου ότι η ανάπτυξη θυγατρικών κλώνων DNA μπορεί να συμβεί ταυτόχρονα και στις δύο έλικες του μητρικού DNA, η πολυμεράση DNA στη δεύτερη αλυσίδα απαιτεί επίσης το δικό της εκκινητή. Έτσι, δύο εκκινητές προστίθενται στο μίγμα της αντίδρασης. Στην πραγματικότητα, οι εκκινητές, έχοντας προσκολληθεί στους αντίθετους κλώνους του μορίου του DNA, περιορίζουν το τμήμα του που στη συνέχεια θα διπλασιαστεί ή θα ενισχυθεί πολλές φορές. Τέτοια θραύσματα DNA ονομάζονται αμπλικόνια. Το μήκος ενός αμπλικονίου μπορεί να είναι αρκετές εκατοντάδες νουκλεοτίδια. Αλλάζοντας ένα ζεύγος εκκινητών, μπορούμε να περάσουμε από την ανάλυση ενός παθογόνου στην ανάλυση ενός άλλου.

Χρόνος ανόπτησης -20-60 sec.

Στάδιο 3:Ολοκλήρωση αλυσίδων DNA (επιμήκυνση).

Ο μηχανισμός αντιγραφής είναι τέτοιος ώστε η συμπληρωματική προσθήκη κλώνων δεν μπορεί να ξεκινήσει σε κανένα σημείο της αλληλουχίας του DNA, αλλά μόνο σε ορισμένα αρχικά μπλοκ (μικρές δίκλωνες τομές). Για τη δημιουργία μπλοκ έναρξης σε δεδομένες τομές DNA, χρησιμοποιούνται εκκινητές, οι οποίοι είναι ολιγονουκλεοτίδια μήκους περίπου 20 bp, που ονομάζονται επίσης εκκινητές. Είναι συμπληρωματικές με τις αλληλουχίες DNA στα αριστερά και δεξιά όρια ενός συγκεκριμένου θραύσματος και είναι προσανατολισμένες με τέτοιο τρόπο ώστε η σύνθεση DNA που πραγματοποιείται από την DNA πολυμεράση να λαμβάνει χώρα μόνο μεταξύ τους.

Η συμπληρωματική ολοκλήρωση των αλυσίδων DNA προχωρά από το 5'-άκρο στο 3'-άκρο της αλυσίδας σε αντίθετες κατευθύνσεις, ξεκινώντας από τις θέσεις προσάρτησης του εκκινητή. Το υλικό για τη σύνθεση νέων αλυσίδων DNA είναι το εισαγόμενο φωσφορικό δεοξυριβονουκλεοτίδιο. Αυτή η διαδικασία καταλύεται από το ένζυμο Tag πολυμεράση. Το νέο DNA που σχηματίζεται στον πρώτο κύκλο σύνθεσης χρησιμεύει ως πρώτη ύλη για τον δεύτερο κύκλο, στον οποίο σχηματίζεται το επιθυμητό ειδικό θραύσμα DNA (αμπλικόνιο) κ.λπ.

Εικ.2 Αρχή ενίσχυσης DNA

Επί του παρόντος, χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι για την προετοιμασία ενός δείγματος για PCR. Η διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος περιλαμβάνει μικροβιακή λύση και εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος. Για την καταστροφή του μικροβιακού κυττάρου χρησιμοποιούνται απλό βρασμό, κατάψυξη-απόψυξη παρουσία λυσοζύμης, καθώς και ειδικά ρυθμιστικά διαλύματα λύσης που περιέχουν απορρυπαντικά και πρωτεϊνάση. Η επιλογή της μεθόδου, κατά κανόνα, υπαγορεύεται από τη φύση του μικροβίου, πιο συγκεκριμένα από τη φύση του κυτταρικό τοίχωμα. Η μέθοδος για τη λήψη ενός παρασκευάσματος καθαρού DNA, που περιγράφεται από τον B.R. Marmionetal, θεωρείται τυπική και έχει ήδη γίνει κλασική. (1993). Περιλαμβάνει ενζυματική πρωτεόλυση που ακολουθείται από αποπρωτεϊνοποίηση και καθίζηση του DNA με αλκοόλη. Αυτή η μέθοδος σάς επιτρέπει να αποκτήσετε ένα καθαρό παρασκεύασμα DNA, αλλά είναι αρκετά εντατική και απαιτεί εργασία με τέτοιες επιθετικές και με έντονη οσμή ουσίες όπως η φαινόλη και το χλωροφόρμιο.

Μία από τις πιο δημοφιλείς είναι η μέθοδος εξαγωγής DNA που προτείνει η R.Boometal. (1990), με βάση τη χρήση ενός ισχυρού παράγοντα λύσης - θειοκυανικής γουανιδίνης (GuSCN) για τη λύση των κυττάρων και την επακόλουθη ρόφηση του DNA σε έναν φορέα (γυάλινες χάντρες, γη διατόμων, γυάλινο «γάλα» κ.λπ.). Μετά το πλύσιμο, το DNA παραμένει στο δείγμα, απορροφημένο στον φορέα, από τον οποίο αφαιρείται εύκολα χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Η μέθοδος είναι βολική, τεχνολογικά προηγμένη και κατάλληλη για την προετοιμασία δείγματος για ενίσχυση. Ωστόσο, η απώλεια DNA είναι δυνατή λόγω μη αναστρέψιμης προσρόφησης στον φορέα, καθώς και κατά τη διάρκεια πολλών πλύσεων. Ειδικά μεγάλης σημασίαςΑυτό έχει ως αποτέλεσμα την εργασία με μικρές ποσότητες DNA σε ένα δείγμα. Επιπλέον, ακόμη και ίχνη GuSCN μπορούν να αναστείλουν την PCR, επομένως είναι πολύ σημαντικό όταν χρησιμοποιείτε αυτήν τη μέθοδο σωστή επιλογήροφητικό και προσεκτική τήρηση των τεχνολογικών αποχρώσεων. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι λόγω του μεγάλου αριθμού βημάτων προσθήκης και αφαίρεσης διαλυμάτων, απαιτείται προσοχή κατά το χειρισμό του δείγματος, καθώς είναι δυνατή η διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων και του προκύπτοντος αερολύματος DNA.

Με την κλασική διαδικασία εκχύλισης DNA φαινόλης-χλωροφορμίου, επιτυγχάνεται καλός καθαρισμός DNA, κυρίως από αναστολείς πολυμεράσης Tag, αλλά μεγάλες απώλειες νουκλεϊκού οξέος είναι αναπόφευκτες, ιδιαίτερα αισθητές όταν εργάζεστε με μικρά δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση του μολυσματικού παράγοντα.

Μια άλλη ομάδα μεθόδων παρασκευής δειγμάτων βασίζεται στη χρήση ιονανταλλακτών όπως το Chilex (ΗΠΑ), οι οποίοι, σε αντίθεση με το γυαλί, δεν απορροφούν το DNA, αλλά τις ακαθαρσίες που παρεμβαίνουν στην αντίδραση. Κατά κανόνα, αυτή η τεχνολογία περιλαμβάνει δύο στάδια: βρασμό του δείγματος και ρόφηση ακαθαρσιών σε έναν εναλλάκτη ιόντων. Η μέθοδος είναι εξαιρετικά ελκυστική λόγω της απλότητας εκτέλεσής της. Στις περισσότερες περιπτώσεις είναι κατάλληλο για εργασία με κλινικό υλικό. Δυστυχώς, μερικές φορές υπάρχουν δείγματα με ακαθαρσίες που δεν μπορούν να αφαιρεθούν χρησιμοποιώντας εναλλάκτες ιόντων. Επιπλέον, ορισμένοι μικροοργανισμοί δεν μπορούν να καταστραφούν με απλό βράσιμο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι απαραίτητο να εισαχθούν πρόσθετα στάδια επεξεργασίας του δείγματος.

Για μαζικό έλεγχο, όταν είναι σημαντικό να ληφθούν στατιστικά δεδομένα, είναι δυνατή η χρήση απλούς τρόπουςχρήση απορρυπαντικών ή επεξεργασία βιολογικού υλικού με αλκάλια με την επακόλουθη εξουδετέρωση τους. Ταυτόχρονα, η χρήση τέτοιων μεθόδων για κλινική διάγνωση μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω της χρήσης σκευάσματος DNA χαμηλής ποιότητας στο μείγμα αντίδρασης. Επομένως, η επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας του δείγματος θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη με την κατανόηση των σκοπών της επιδιωκόμενης ανάλυσης.

Κατά την επόμενη διαδικασία - ενίσχυση - ένα δείγμα που περιέχει το DNA του παθογόνου εισάγεται σε ένα μικρό δοκιμαστικό σωλήνα με συστατικά που διασφαλίζουν την αντίδραση πολυμεράσης, δύο τύπους εκκινητών, δύο ένζυμα (Tag πολυμεράση και Ν-ουρακίλη γλυκολάση) και τέσσερις τύπους νουκλεοτίδιο A, G, Ts, U. Για τη διεξαγωγή της αντίδρασης πολυμεράσης, χρησιμοποιείται μια ειδική συσκευή (θερμικός κυκλοποιητής ή ενισχυτής DNA), η οποία σας επιτρέπει να αλλάζετε αυτόματα τη θερμοκρασία του μείγματος αντίδρασης σύμφωνα με ένα συγκεκριμένο πρόγραμμα. Στον πρώτο γύρο της PCR, το δείγμα θερμαίνεται σε θερμοκρασία 94°C για να διαχωριστούν οι δύο συμπληρωματικοί κλώνοι DNA. Η θερμοκρασία στη συνέχεια πέφτει στους 40-60°C, στο οποίο σημείο οι εκκινητές συνδέονται με ένα μόνο κλώνο DNA, μετά από το οποίο η θερμοκρασία αυξάνεται ξανά στους 72°C, όταν η δραστικότητα πολυμεράσης είναι πιο έντονη. Ολόκληρος ο κύκλος με αλλαγές θερμοκρασίας διαρκεί λιγότερο από 3 λεπτά.

Για να αξιολογηθούν σωστά τα αποτελέσματα της PCR, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ότι αυτή η μέθοδος δεν είναι ποσοτική. Θεωρητικά, τα προϊόντα ενίσχυσης μορίων DNA μεμονωμένων στόχων μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση μετά από 30-35 κύκλους. Ωστόσο, στην πράξη, αυτό γίνεται μόνο σε περιπτώσεις που η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε συνθήκες κοντά στο ιδανικό, κάτι που είναι σπάνιο. Ο βαθμός καθαρότητας του παρασκευάσματος DNA έχει ιδιαίτερα μεγάλη επίδραση στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης, δηλ. η παρουσία στο μείγμα αντίδρασης ορισμένων αναστολέων, από τους οποίους σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να είναι εξαιρετικά δύσκολο να απαλλαγούμε. Μερικές φορές, λόγω της παρουσίας τους, ακόμη και δεκάδες χιλιάδες μόρια DNA στόχοι δεν μπορούν να ενισχυθούν. Έτσι, συχνά δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ της αρχικής ποσότητας του DNA στόχου και της τελικής ποσότητας προϊόντων ενίσχυσης.

Για να οπτικοποιήσετε τα αποτελέσματα της ενίσχυσης, χρησιμοποιήστε διάφορες μεθόδους. Η πιο διαδεδομένη σήμερα είναι η ηλεκτροφόρηση, που βασίζεται στον διαχωρισμό των μορίων DNA κατά μέγεθος. Για να γίνει αυτό, παρασκευάστε μια πλάκα γέλης αγαρόζης, η οποία στερεοποιείται αγαρόζη μετά από τήξη σε ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης σε συγκέντρωση 1,5-2,5% με την προσθήκη ειδικής χρωστικής DNA, για παράδειγμα βρωμιούχου αιθιδίου. Η στερεοποιημένη αγαρόζη σχηματίζει ένα χωρικό πλέγμα. Κατά την έκχυση χρησιμοποιώντας χτένες, σχηματίζονται ειδικά φρεάτια στο πήκτωμα, στα οποία στη συνέχεια προστίθενται προϊόντα ενίσχυσης. Η πλάκα γέλης τοποθετείται σε μια οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης γέλης και συνδέεται μια πηγή σταθερής τάσης. Το αρνητικά φορτισμένο DNA αρχίζει να κινείται στο πήκτωμα από το μείον στο συν. Σε αυτή την περίπτωση, τα μικρότερα μόρια DNA κινούνται πιο γρήγορα από τα μακρύτερα. Η ταχύτητα της κίνησης του DNA στο πήκτωμα επηρεάζεται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης, την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, τη θερμοκρασία, τη σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης και, σε μικρότερο βαθμό, τη σύνθεση του DNA. Όλα τα μόρια του ίδιου μεγέθους κινούνται με την ίδια ταχύτητα. Η χρωστική ενσωματώνεται (ενσωματώνεται) από επίπεδες ομάδες σε μόρια DNA. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, η οποία διαρκεί από 10 λεπτά έως 1 ώρα, η γέλη τοποθετείται σε ένα φίλτρο transilluminator που εκπέμπει φως στην περιοχή υπεριώδους (254 - 310 nm). Η υπεριώδης ενέργεια που απορροφάται από το DNA στα 260 nm μεταφέρεται στη βαφή, προκαλώντας τον φθορισμό της στην πορτοκαλοκόκκινη περιοχή του ορατού φάσματος (590 nm).

Το πρότυπο DNA του επιθυμητού μικροοργανισμού χρησιμοποιείται ως «θετικός έλεγχος». Το μέγεθος των μη ειδικών αμπλικονίων μπορεί να είναι είτε μεγαλύτερο είτε μικρότερο σε σύγκριση με τον «θετικό έλεγχο». Στη χειρότερη περίπτωση, αυτά τα μεγέθη μπορεί να συμπίπτουν και να διαβάζονται ως θετικά στην ηλεκτροφόρηση.

Ο "Θετικός έλεγχος" σάς επιτρέπει να βεβαιωθείτε ότι όλα τα συστατικά που περιλαμβάνονται στο μείγμα αντίδρασης διασφαλίζουν την κανονική πρόοδο της αντίδρασης. Ταυτόχρονα, ένα παρασκεύασμα DNA που παρασκευάζεται για PCR από βιολογικό υλικό μπορεί να περιέχει ακαθαρσίες αναστολέων, που μειώνουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης και σε ορισμένες περιπτώσεις οδηγούν στην απουσία ειδικών αμπλικονίων ακόμη και παρουσία του επιθυμητού παθογόνου. Είναι απαραίτητο να παρακολουθείται η πρόοδος της ενίσχυσης σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα με το μείγμα αντίδρασης, για το οποίο χρησιμοποιείται ένας πρόσθετος λεγόμενος «εσωτερικός έλεγχος», που είναι οποιοδήποτε πρότυπο DNA που είναι διαφορετικό από το DNA του επιθυμητού μικροοργανισμού.

Για μολυσματικά συστήματα δοκιμής, μερικές φορές, για παράδειγμα, χρησιμοποιείται το γονίδιο p-σφαιρίνης, στα άκρα του οποίου, χρησιμοποιώντας χειρισμούς γενετικής μηχανικής, ράβονται τμήματα DNA ομόλογα με τους εκκινητές που περιλαμβάνονται στο σύστημα δοκιμής. Εάν προστεθεί ένας «εσωτερικός μάρτυρας» στο μείγμα της αντίδρασης, θα γίνει ο ίδιος στόχος για την ανόπτηση του εκκινητή με το χρωμοσωμικό DNA του επιθυμητού μολυσματικού παράγοντα. Το μέγεθος του προϊόντος ενίσχυσης εσωτερικού ελέγχου επιλέγεται έτσι ώστε να είναι 2 ή περισσότερες φορές μεγαλύτερο από τα αμπλικόνια που σχηματίζονται από την ενίσχυση του επιθυμητού DNA μικροοργανισμού. Ως αποτέλεσμα, εάν στο μείγμα αντίδρασης προστεθεί DNA «εσωτερικού ελέγχου» μαζί με το δείγμα δοκιμής, τότε, ανεξάρτητα από την παρουσία μικροοργανισμού στο βιολογικό δείγμα, ο «εσωτερικός έλεγχος» θα προκαλέσει το σχηματισμό συγκεκριμένων αμπλικονίων, αλλά σημαντικά μεγαλύτερο (βαρύτερο) από το αμπλικόνιο του μικροοργανισμού. Η παρουσία βαρέων αμπλικονίων στο μίγμα αντίδρασης υποδηλώνει την κανονική πρόοδο της αντίδρασης ενίσχυσης και την απουσία αναστολέων. Εάν δεν σχηματιστούν αμπλικόνια του απαιτούμενου μεγέθους και «εσωτερικού ελέγχου», μπορούμε να συμπεράνουμε ότι υπάρχουν ανεπιθύμητες ακαθαρσίες στο αναλυόμενο δείγμα που πρέπει να εξαλειφθούν, αλλά όχι για την απουσία του επιθυμητού DNA.

Παρά την ελκυστικότητα αυτής της προσέγγισης, έχει ένα σημαντικό ελάττωμα. Έτσι, εάν το επιθυμητό DNA υπάρχει στο μείγμα αντίδρασης, τότε η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης του μειώνεται απότομα λόγω του ανταγωνισμού με τον «εσωτερικό έλεγχο» για εκκινητές. Αυτό είναι θεμελιωδώς σημαντικό όταν χαμηλές συγκεντρώσεις DNA στο δείγμα δοκιμής και μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Ωστόσο, υπό την προϋπόθεση ότι λυθεί το πρόβλημα του ανταγωνισμού για εκκινητές, αυτή η μέθοδος παρακολούθησης της απόδοσης ενίσχυσης θα είναι σίγουρα πολύ χρήσιμη.

Εικ. 3 Δεύτερος κύκλος ενίσχυσης DNA

. Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης

). Μέθοδος οριζόντιας ηλεκτροφόρησης

Μία από τις μεθόδους οπτικοποίησης των αποτελεσμάτων ενίσχυσης είναι η μέθοδος ηλεκτροφόρησης, που βασίζεται στον διαχωρισμό των μορίων DNA κατά μέγεθος. Στις περισσότερες μεθόδους, σε αυτό το στάδιο, το μείγμα των προϊόντων ενίσχυσης που λαμβάνεται στο 2ο στάδιο διαχωρίζεται με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Πριν από τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό, ένα διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου προστίθεται στο μείγμα ενίσχυσης, το οποίο σχηματίζει ισχυρές ενδιάμεσες ενώσεις με δίκλωνα θραύσματα DNA. Αυτές οι ενώσεις είναι ικανές να φθορίζουν υπό ακτινοβολία UV, η οποία καταγράφεται με τη μορφή φωτεινών ζωνών μετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό του μίγματος ενίσχυσης σε πήκτωμα αγαρόζης. Η φωτεινότητα των ζωνών του προϊόντος ενίσχυσης μπορεί να διαφέρει. Ως εκ τούτου, είναι συχνά σύνηθες στα εργαστήρια PCR να αξιολογούν το αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τριών, τεσσάρων ή πέντε σημείων. Ωστόσο, δεν μπορεί να συσχετιστεί με την αρχική ποσότητα του DNA στόχου στο δείγμα. Συχνά, μια μείωση της φωτεινότητας των ζωνών σχετίζεται με μείωση της απόδοσης ενίσχυσης υπό την επίδραση αναστολέων ή άλλων παραγόντων.

Εικ.4 Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης με οριζόντια ηλεκτροφόρηση

). Μέθοδος κάθετης ηλεκτροφόρησης

Η μέθοδος της κάθετης ηλεκτροφόρησης είναι ουσιαστικά παρόμοια με την οριζόντια ηλεκτροφόρηση. Η διαφορά τους είναι ότι σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιείται πολυακρυλαμίδιο αντί για αγαρόζη. Πραγματοποιείται σε ειδικό θάλαμο για κάθετη ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου έχει μεγαλύτερη ανάλυση σε σύγκριση με την ηλεκτροφόρηση αγαρόζης και επιτρέπει σε κάποιον να διακρίνει μόρια DNA διαφορετικών μεγεθών με ακρίβεια ενός νουκλεοτιδίου. Η παρασκευή γέλης πολυακρυλαμιδίου είναι κάπως πιο περίπλοκη από τη γέλη αγαρόζης. Επιπλέον, το ακρυλαμίδιο είναι μια τοξική ουσία. Δεδομένου ότι σπάνια προκύπτει η ανάγκη προσδιορισμού του μεγέθους ενός προϊόντος ενίσχυσης με ακρίβεια 1 νουκλεοτιδίου, αυτή η μέθοδος δεν χρησιμοποιείται σε εργασίες ρουτίνας.

3). Μέθοδος ανιχνευτή υβριδισμού

Ως εναλλακτική της μεθόδου ηλεκτροφορητικής ανίχνευσης, η οποία έχει ορισμένα μειονεκτήματα: υποκειμενικότητα στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων, περιορισμοί στον προσδιορισμό του DNA διαφόρων μικροοργανισμών σε μία αντίδραση, μπορούν να προταθούν σχήματα ανίχνευσης υβριδισμού. Σε αυτά τα σχήματα, το θραύσμα DNA που σχηματίζεται ως αποτέλεσμα της ενίσχυσης υβριδοποιείται (σχηματίζει 2κλωνα σύμπλοκα - "υβρίδια") με έναν ειδικό ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή. Η καταχώριση τέτοιων συμπλεγμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρωματομετρικά ή φθοριομετρικά.

3. ΜΕΘΟΔΟΣ PCR σε πραγματικό χρόνο (PCR σε πραγματικό χρόνο)

Η μέθοδος Real-Time PCR καθιστά δυνατή την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και την παρακολούθηση της κινητικής της συσσώρευσης αμπλικονίου. Για την ανίχνευση ενός προϊόντος PCR, χρησιμοποιούνται φθορίζουσες βαφές που παρέχουν φθορισμό άμεσα ανάλογο με την ποσότητα του προϊόντος PCR - φθορισμού αναφοράς. Οι μηχανισμοί για την παραγωγή του ποικίλλουν ανάλογα με τον συγκεκριμένο τύπο PCR σε πραγματικό χρόνο.

Η κινητική καμπύλη στις συντεταγμένες «Επίπεδο φθορισμού αναφοράς - κύκλος ενίσχυσης» έχει σχήμα S.

Μπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια:

1.Στάδιο έναρξης (όταν τα προϊόντα PCR δεν ανιχνεύονται ακόμη με φθορίζουσα ετικέτα).

2.Εκθετικό στάδιο (στο οποίο υπάρχει εκθετική εξάρτηση της ποσότητας του φθορισμού από τον κύκλο της PCR).

.Οροπέδιο (στάδιο κορεσμού).

Εικ.5 Γράφημα κινητικής καμπύλης φθορισμού με χρήση PCR πραγματικού χρόνου

Η καταχώρηση του φθορίζοντος σήματος πραγματοποιείται κατά τη διαδικασία ενίσχυσης σε μια ειδική συσκευή - έναν θερμικό κυκλοποιητή για Real-Time PCR. Με βάση την αύξηση της έντασης του σήματος φθορισμού, η συγκέντρωση του αρχικού προτύπου DNA υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το λογισμικό που παρέχεται με τον ενισχυτή.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου PCR σε πραγματικό χρόνο

n την ικανότητα ανίχνευσης της συσσώρευσης προϊόντων ενίσχυσης απευθείας κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης·

n το θεμελιώδες πλεονέκτημα είναι η ικανότητα ανίχνευσης της συσσώρευσης αμπλικονίων χωρίς άνοιγμα του σωλήνα, γεγονός που ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων λόγω μόλυνσης των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων με προϊόντα ενίσχυσης.

n μια σημαντική μείωση του αριθμού των χειρισμών με το δείγμα δοκιμής μειώνει το χρόνο, απλοποιεί την ανάλυση και μειώνει την πιθανότητα σφαλμάτων.

n Αυτή η προσέγγιση καθιστά δυνατή την εξάλειψη του σταδίου ηλεκτροφόρησης, γεγονός που οδηγεί σε απότομη μείωση της πιθανότητας μόλυνσης των δειγμάτων δοκιμής με προϊόντα ενίσχυσης.

n μείωση των απαιτήσεων για εργαστήρια PCR.

n αύξηση της αντικειμενικότητας της ερμηνείας των αποτελεσμάτων μιας μελέτης PCR, δεδομένου ότι η επεξεργασία πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας το λογισμικό της συσκευής.

n μειώνεται σημαντικά, σχεδόν στο μισό συνολικός χρόνοςΗ έρευνα σάς επιτρέπει να λάβετε αποτελέσματα εντός 1,5 - 2 ωρών μετά την άφιξη του κλινικού υλικού στο εργαστήριο.

n Αυτή η μέθοδος επιτρέπει για πρώτη φορά τον ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε DNA ενός μικροοργανισμού σε ένα κλινικό δείγμα.

n Η χρήση ανιχνευτών υβριδισμού μαζί με εκκινητές αυξάνει την ειδικότητα της ανάλυσης.

n η δυνατότητα ανεξάρτητης ταυτόχρονης καταχώρησης του φθορίζοντος σήματος από πολλούς ανιχνευτές DNA υβριδισμού επιτρέπει την ταυτοποίηση σε μία μελέτη πολλών διαφορετικών περιοχών του ίδιου ή διαφορετικών στόχων DNA.

. ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

n Άμεση αναγνώριση παθογόνων μολυσματικών ασθενειών

Η μέθοδος PCR δίνει μια άμεση ένδειξη της παρουσίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA του παθογόνου στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή.

n Υψηλή ειδικότητα της PCR

Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR, ένα θραύσμα DNA απομονώνεται στο υπό μελέτη υλικό που είναι μοναδικό για ένα συγκεκριμένο παθογόνο - ένα βακτήριο ή έναν ιό. Αυτό το τμήμα DNA είναι μοναδικό και δεν είναι τυπικό για οποιαδήποτε μόλυνση στη γη. Η εξειδίκευση προσδιορίζεται από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων των εκκινητών, η οποία εξαλείφει την πιθανότητα λήψης ψευδών αποτελεσμάτων, σε αντίθεση με τη μέθοδο ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας συνδεδεμένης με ένζυμο, όπου είναι κοινά σφάλματα λόγω διασταυρούμενης αντίδρασης αντιγόνων.

n PCR υψηλής ευαισθησίας

Η μέθοδος PCR σάς επιτρέπει να ανιχνεύσετε ακόμη και μεμονωμένα κύτταρα βακτηρίων ή ιών. Η διάγνωση PCR ανιχνεύει την παρουσία παθογόνων μολυσματικών ασθενειών σε περιπτώσεις που αυτό δεν μπορεί να γίνει με άλλες μεθόδους (ανοσολογικές, βακτηριολογικές, μικροσκοπικές). Η ευαισθησία της ανάλυσης PCR είναι 10-1000 κύτταρα ανά δείγμα (η ευαισθησία των ανοσολογικών και μικροσκοπικών εξετάσεων είναι 103-105 κύτταρα).

n Η ευελιξία της PCR

Δεδομένου ότι το παθογόνο μπορεί να περιέχεται σε οποιεσδήποτε βιολογικές εκκρίσεις και ιστούς, η έρευνα PCR μπορεί να χρησιμοποιήσει σχεδόν οποιοδήποτε υλικό, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δεν είναι προσβάσιμα για έρευνα με άλλες μεθόδους - βλέννα, ούρα, αίμα, ορός, πτύελα, εκσπερμάτιση, ξύσεις επιθηλιακών κυττάρων.

n Υψηλή ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων ανάλυσης PCR

Η ανάλυση PCR δεν απαιτεί απομόνωση και ανάπτυξη καλλιέργειας του παθογόνου, η οποία απαιτεί πολύ χρόνο. Μια ενοποιημένη μέθοδος για την επεξεργασία βιοϋλικών και την ανίχνευση προϊόντων αντίδρασης και η αυτοματοποίηση της διαδικασίας ενίσχυσης καθιστούν δυνατή τη διεξαγωγή μιας πλήρους ανάλυσης σε 4-4,5 ώρες.

n Δυνατότητα διάγνωσης κάθε είδους μόλυνσης

Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου PCR καθιστά δυνατή τη διάγνωση λοίμωξης όχι μόνο στο οξύ στάδιο της νόσου, αλλά και χρόνιων λοιμώξεων, ακόμη και της παρουσίας μεμονωμένων βακτηρίων ή ιών.

Επί του παρόντος, το πλεονέκτημα της ανάλυσης PCR έναντι της μεθόδου καλλιέργειας για την ανίχνευση μικροοργανισμών είναι το εξής:

Περισσότερο υψηλή συχνότηταανίχνευση μικροβίων, που υπερβαίνει τον ίδιο δείκτη κατά τη χρήση της μεθόδου καλλιέργειας κατά 6-7%. Αυτές οι διαφορές εξηγούνται από τον πιθανό θάνατο του μικροβίου κατά την αποθήκευση και τη μεταφορά, ενώ η PCR είναι ικανή να ανιχνεύσει μη βιώσιμες μορφές του μικροοργανισμού.

Ο χρόνος που απαιτείται για την ανίχνευση ενός παθογόνου με τη μέθοδο της καλλιέργειας είναι περίπου 4 ημέρες, ενώ η χρήση PCR επιτρέπει την ανίχνευση του μικροβίου σε 4-5 ώρες.

Η χρήση της τεχνολογίας PCR επιτρέπει την ανίχνευση παθογόνων παραγόντων, όπως τα χλαμύδια, σε δείγματα που λαμβάνονται μη επεμβατικά, όπως τα ούρα.

Η μέθοδος PCR είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για τη διάγνωση δύσκολα καλλιεργήσιμων, μη καλλιεργήσιμων και επίμονων μορφών μικροοργανισμών, οι οποίοι απαντώνται συχνά σε λανθάνουσες και χρόνιες λοιμώξεις, καθώς αυτή η μέθοδος αποφεύγει τις δυσκολίες που συνδέονται με την ανάπτυξη τέτοιων μικροοργανισμών σε εργαστηριακές συνθήκες.

n Δυνατότητα διενέργειας παρακολούθηση και αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, ειδικά για ιογενείς ασθένειες.

n Δυνατότητα ανίχνευσης μεμονωμένους υποτύπους και στελέχη ιών και βακτηρίων.

n Δυνατότητα ορισμού διάφορους τύπους παθογόνων (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) από ένα σωληνάριο με βιολογικό υλικό.

Αυτή η μέθοδος είναι συγκρίσιμη σε ένταση εργασίας με κλασικές μεθόδους(ενζυμική ανοσοδοκιμασία, ανοσοφθορισμός κ.λπ.), αλλά παρέχει πιο αξιόπιστες διαγνωστικές πληροφορίες, επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση DNA ή RNA ενός μολυσματικού παράγοντα σε κλινικό υλικό. Ως εκ τούτου, η μέθοδος PCR, μαζί με τη μέθοδο καλλιέργειας, αναγνωρίζεται ως το «χρυσό πρότυπο» για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.

5. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

· Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, ενισχύεται το DNA τόσο των ζωντανών όσο και των νεκρών μικροοργανισμών

· Πιθανότητα διασταυρούμενης αντίδρασης

Η επιλογή των εκκινητών βασίζεται στην υπάρχουσα γνώση για το γονιδίωμα ενός δεδομένου και παρόμοιων μικροοργανισμών. Θεωρητικά, υπάρχει πιθανότητα το ίδιο θραύσμα να υπάρχει και σε άλλους μικροοργανισμούς των οποίων το γονιδίωμα δεν έχει αποκρυπτογραφηθεί επί του παρόντος και οι οποίοι δεν έχουν ελεγχθεί για τη δυνατότητα διασταυρούμενης αντίδρασης. Η παρουσία τέτοιων μικροοργανισμών στο δείγμα μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικό αποτέλεσμα της δοκιμής.

· Μεταβλητότητα μικροοργανισμών

Αν και κατά την κατασκευή ενός συστήματος δοκιμής, το θραύσμα γονιδιώματος που χρησιμοποιείται για ενίσχυση επιλέγεται από μια εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή, η μεταβλητότητα των μικροοργανισμών μπορεί να οδηγήσει στο γεγονός ότι ορισμένοι γονότυποι ή στελέχη του υπό μελέτη παθογόνου μπορεί να αποκτήσουν μεταλλάξεις στην ενισχυμένη περιοχή του γονιδιώματος , και έτσι γίνονται άπιαστα για αυτό το σύστημα δοκιμής.

Τα δύο τελευταία σημεία είναι σημαντικά για τους προγραμματιστές διαγνωστικών κιτ PCR. Τώρα έχουν αναπτυχθεί πρότυπα για τη ρύθμιση του όγκου των δοκιμών (συμπεριλαμβανομένων των δοκιμών για διασταυρούμενες αντιδράσεις, καθώς και δοκιμών γνωστών στελεχών του παθογόνου που ανιχνεύεται) στις οποίες πρέπει να υποβληθεί ένα σύστημα δοκιμής πριν φτάσει στην αγορά.

6. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR

πολυμεράση διαγνωστική λοιμώδη νόσο

Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς για ανάλυση και επιστημονικά πειράματα:

1. ιατροδικαστική

Η PCR χρησιμοποιείται για τη σύγκριση των λεγόμενων «γενετικών δακτυλικών αποτυπωμάτων». Απαιτείται δείγμα γενετικού υλικού από τον τόπο του εγκλήματος - αίμα, σάλιο, σπέρμα, μαλλιά κ.λπ. Αυτό συγκρίνεται με το γενετικό υλικό του υπόπτου. Αρκεί πολύ μικρή ποσότητα DNA, θεωρητικά ένα αντίγραφο. Το DNA διασπάται σε θραύσματα και στη συνέχεια ενισχύεται χρησιμοποιώντας PCR. Τα θραύσματα διαχωρίζονται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση DNA. Το προκύπτον μοτίβο της διάταξης των ζωνών DNA ονομάζεται γενετικό δακτυλικό αποτύπωμα.

2. καθιέρωση πατρότητας

Κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA που ενισχύθηκαν με τη χρήση PCR πατέρα-παιδιού-μητέρας, ανακαλύπτεται ότι το παιδί θα κληρονομήσει ορισμένα χαρακτηριστικά του γενετικού αποτυπώματος και των δύο γονέων, γεγονός που δίνει ένα μοναδικό αποτύπωμα. Αν και τα γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα είναι μοναδικά (εκτός από την περίπτωση των πανομοιότυπων διδύμων), οι οικογενειακές σχέσεις μπορούν ακόμα να δημιουργηθούν με τη λήψη πολλών δακτυλικών αποτυπωμάτων. Η ίδια μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί, ελαφρώς τροποποιημένη, για να εδραιωθεί η εξελικτική συγγένεια μεταξύ των οργανισμών.

3. ιατρικά διαγνωστικά

Η PCR καθιστά δυνατή τη σημαντική επιτάχυνση και διευκόλυνση της διάγνωσης κληρονομικών και ιογενών ασθενειών. Το γονίδιο ενδιαφέροντος ενισχύεται με PCR χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές και στη συνέχεια προσδιορίζεται η αλληλουχία για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων. Ιογενείς λοιμώξειςμπορεί να ανιχνευθεί αμέσως μετά τη μόλυνση, εβδομάδες ή μήνες πριν εμφανιστούν τα συμπτώματα.

4. γονιδιακή κλωνοποίηση

Η κλωνοποίηση γονιδίων είναι η διαδικασία απομόνωσης γονιδίων και, ως αποτέλεσμα χειρισμών γενετικής μηχανικής, απόκτησης μεγάλης ποσότητας του προϊόντος ενός δεδομένου γονιδίου. Η PCR χρησιμοποιείται για την ενίσχυση ενός γονιδίου, το οποίο στη συνέχεια εισάγεται σε έναν φορέα - ένα κομμάτι DNA που μεταφέρει ένα ξένο γονίδιο στον ίδιο ή σε άλλον οργανισμό κατάλληλο για ανάπτυξη. Για παράδειγμα, πλασμίδια ή ιικό DNA χρησιμοποιούνται ως φορείς. Η εισαγωγή γονιδίων σε έναν ξένο οργανισμό χρησιμοποιείται συνήθως για την παραγωγή του προϊόντος αυτού του γονιδίου - RNA ή, πιο συχνά, μιας πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο, πολλές πρωτεΐνες λαμβάνονται σε βιομηχανικές ποσότητες για χρήση σε γεωργία, φάρμακα κ.λπ.

5. Αλληλουχία DNA

Στη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας που χρησιμοποιεί διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσα επισήμανση ή ραδιενεργό ισότοπο, η PCR είναι αναπόσπαστο μέρος, καθώς κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού εισάγονται στην αλυσίδα του DNA παράγωγα νουκλεοτιδίων σημασμένων με φθορίζουσα ή ραδιενεργή επισήμανση. Αυτό σταματά την αντίδραση, επιτρέποντας τον προσδιορισμό των θέσεων συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων μετά τον διαχωρισμό των συντιθέμενων αλυσίδων στο πήκτωμα.

6. μεταλλαξιογένεση

Επί του παρόντος, η PCR έχει γίνει η κύρια μέθοδος για τη διεξαγωγή μεταλλαξιογένεσης (τροποποίηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA). Η χρήση της PCR κατέστησε δυνατή την απλούστευση και την επιτάχυνση της διαδικασίας μεταλλαξιογένεσης, καθώς και να την καταστήσει πιο αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη.

7. διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων

Η χρήση της μεθόδου PCR για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών τόσο βακτηριακής όσο και ιογενούς φύσης είναι τεράστιας σημασίας για την επίλυση πολλών προβλημάτων μικροβιολογίας και επιδημιολογίας. Η χρήση αυτής της μεθόδου συμβάλλει επίσης στην ανάπτυξη βασικής έρευνας στον τομέα της μελέτης των χρόνιων και ελάχιστα κατανοητών λοιμωδών νοσημάτων.

8. διάγνωση ιογενών ασθενειών

Τα πιο ολοκληρωμένα οφέλη της PCR στη διάγνωση ιογενών ασθενειών μπορούν να αποδειχθούν λαμβάνοντας υπόψη τη λοιμώδη διαδικασία που προκαλείται από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV). Η PCR έχει ιδιαίτερη διαγνωστική αξία για την ανίχνευση αυτού του ιού για τους ακόλουθους λόγους:

) έλλειψη μεθόδου για την καλλιέργεια του HCV. 2) δεν υπάρχουν κιτ διάγνωσης αντιγόνου. 3) η αντίδραση του σχηματισμού αντισωμάτων στο HCV είναι τόσο αργή που κατά κανόνα δεν μπορεί να γίνει διάγνωση κατά την οξεία φάση της μόλυνσης.

Ως εκ τούτου, η χρήση της τεχνολογίας PCR για τη διάγνωση, τον ποιοτικό έλεγχο της θεραπείας και την επιδημιολογική ανάλυση της νοσηρότητας που προκαλείται από τον HCV γίνεται πλέον γενικά αποδεκτή.

Ταυτόχρονα, μόνο η τεχνολογία PCR επιτρέπει την επίλυση των παρακάτω προβλημάτων: 1) διαγνωστικά οξεία μόλυνσημε καθυστερημένη ανίχνευση αντισωμάτων κατά του HCV. 2) διενέργεια αιτιολογικής διάγνωσης χρόνια ηπατίτιδα C σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. 3) αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της αντιιικής θεραπείας. 4) ανίχνευση ιαιμίας σε αιμοδότες με κανονικό επίπεδοαμινοτρανσφεράσες; 5) να προσδιορίσει πιθανή μόλυνση προϊόντων αίματος. 6) εκτίμηση του επιπολασμού του HCV.

9. εφαρμογή της PCR στην πνευμονολογία και τη φθισιολογία

Συχνή αιτία άτυπης πνευμονίας, υποτροπιάζουσας χρόνια βρογχίτιδαείναι το μυκόπλασμα και τα χλαμύδια. Η διάγνωση αυτών των παθογόνων με χρήση παραδοσιακών μεθόδων μικροσκοπίας και βακτηριακής καλλιέργειας είναι αναποτελεσματική. Η PCR επιτρέπει όχι μόνο τη διάγνωση χλαμυδίων και μυκοπλάσμωσης, αλλά και την ταυτοποίηση ειδών του παθογόνου (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Η χρήση της μεθόδου PCR μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την έγκαιρη διάγνωση της φυματίωσης. Επί του παρόντος, έχουν αναπτυχθεί και εμφανιστεί στην αγορά κιτ PCR για τον προσδιορισμό της αντοχής των μυκοβακτηρίων στα αντιβιοτικά.

10. Εφαρμογή της PCR στην πρακτική της υπηρεσίας αίματος

Επισκόπηση έδωσε αίμαο έλεγχος για ηπατίτιδα, σύφιλη, HIV με ορολογικές μεθόδους δεν εξαλείφει τον κίνδυνο χρήσης μολυσμένου αίματος λόγω της παρουσίας μιας ορισμένης οροαρνητικής περιόδου για αυτές τις ασθένειες, η οποία μπορεί να διαρκέσει έως και αρκετές εβδομάδες από τη στιγμή που το παθογόνο εμφανίζεται στο αίμα. Η πιο αποτελεσματική μέθοδος για τον έλεγχο του αίματος για την παρουσία αυτών των παθογόνων είναι η μέθοδος PCR.

11. εφαρμογή της PCR στη νεογνολογία

Ένας αριθμός μικροοργανισμών μπορεί να μολύνει το έμβρυο κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Πρόκειται για τον κυτταρομεγαλοϊό, το τοξόπλασμα, τον ιό του έρπητα, τον ιό της ερυθράς, το μυκόπλασμα, τα χλαμύδια κ.λπ. Η χρήση ορολογικών εξετάσεων για τον προσδιορισμό αυτών των λοιμώξεων στα νεογνά είναι αναποτελεσματική, αφού ο σχηματισμός ανοσοποιητικό σύστημασε ένα παιδί εμφανίζεται σε διάστημα αρκετών μηνών και η παρουσία ενός μολυσματικού παράγοντα μπορεί να μην συνοδεύεται από την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων. Από την άλλη πλευρά, μητρικά αντισώματα της κατηγορίας IgG μπορεί να υπάρχουν στο αίμα ενός νεογνού για μεγάλο χρονικό διάστημα, ικανά να διαπεράσουν τον φραγμό του πλακούντα. Έτσι, η παρουσία ειδικής IgG σε ένα παιδί τους πρώτους μήνες της ζωής δεν υποδηλώνει την παρουσία παθογόνου. Η χρήση της ανάλυσης PCR αυξάνει σημαντικά τις δυνατότητες διάγνωσης νεογνικών λοιμώξεων, ακόμη και στο ενδομήτριο στάδιο.

12. εφαρμογή της PCR στην ουρογυναικολογική πρακτική

Μεταξύ των μολυσματικών παραγόντων που επηρεάζουν την ουρογεννητική οδό, έχει δοθεί πρόσφατα μεγάλη προσοχή στους αιτιολογικούς παράγοντες των λανθάνοντων και χρόνιων λοιμώξεων - τα χλαμύδια και το μυκόπλασμα. Οι ασθένειες που προκαλούνται από αυτά τα παθογόνα χαρακτηρίζονται από θολά κλινικά συμπτώματα, χρόνια πορεία, συχνά οδηγεί σε βλάβες στις αναπαραγωγικές λειτουργίες - αποβολή, στειρότητα. Πολυάριθμες μελέτες που εξετάζουν τη χρήση της μεθόδου PCR για την ανίχνευση Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, που πραγματοποιήθηκαν σε μεγάλες κλινικές σε διάφορες χώρες, έδειξαν υψηλής απόδοσης αυτή τη μέθοδο. Αναγνωρίζεται ότι όσον αφορά την ευαισθησία και την αποτελεσματικότητα, η PCR είναι ανώτερη από τη μέθοδο καλλιέργειας, αποδεκτή ως «χρυσό πρότυπο».

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Έτσι, η τεχνολογία PCR είναι ένα ισχυρό εργαλείο που καθιστά δυνατή τη μελέτη και τη διάγνωση της χρόνιας μολυσματικές διεργασίες, οικολογία παθογόνων μολυσματικών ασθενειών. Η διαγνωστική μέθοδος PCR συμπληρώνει ήδη υπάρχουσες μεθόδους μικροβιολογικής διάγνωσης και αλλάζει ποιοτικά τη μεθοδολογία για την επίλυση εφαρμοσμένων προβλημάτων της ιατρικής μικροβιολογίας και επιδημιολογίας.

Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, ας διαμορφώσουμε κατευθύνσεις έρευνας στο λοιμώδης παθολογία, στην επίλυση του οποίου η PCR αρχίζει να παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο.

Διάγνωση χρόνιων λοιμωδών καταστάσεων που προκαλούνται από την επιμονή βακτηρίων ή ιών. Αυτή είναι η πιο προφανής εφαρμογή της PCR για διαγνωστικούς σκοπούς.

Η PCR είναι η μεγαλύτερη αποτελεσματική μέθοδοςνα εντοπίσει και να μελετήσει παθογόνα που, όντας σε «ακαλλιέργητη» κατάσταση, μπορούν να επιμείνουν εκεί, επιζώντας από δυσμενείς εξωτερικές συνθήκες.

Η PCR επιτρέπει τον προσδιορισμό της αντοχής στα αντιβιοτικά σε βραδέως αναπτυσσόμενα και δύσκολα καλλιεργήσιμα βακτήρια.

Υποσχόμενοι τομείς για την πρακτική χρήση των διαγνωστικών PCR είναι:

· διαγνωστικά ογκολογικά νοσήματα;

· διάγνωση λευχαιμίας και λεμφωμάτων.

· διάγνωση καρκίνου του μαστού.

· διάγνωση άλλων κακοήθων ασθενειών.

DNA διάγνωση καλοήθων και κακοήθη νεοπλάσματαπεριορίζεται από ένα μικρό αλλά αυξανόμενο σύνολο γνώσεων σχετικά με τα γονίδια που σχετίζονται με αυτές τις ασθένειες.

· διαγνωστικά γενετικές ασθένειες.

Η διάγνωση γενετικών ασθενειών μπορεί να αναπτυχθεί μόνο μετά από εκτεταμένη επιστημονική έρευνα στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Ωστόσο, η ιατρική κοινότητα έχει ήδη αναγνωρίσει τη σημασία της μελέτης της γενετικής βάσης των ασθενειών, καθώς και της δυνατότητας διάγνωσης και θεραπείας μιας ασθένειας πριν εμφανιστούν τα συμπτώματά της.

Προσωπική αναγνώριση: ιατροδικαστική, εγκληματολογία; μεταμόσχευση οργάνων και ιστών· προσδιορισμός της πατρότητας. Οι ειδικοί αξιολογούν αυτόν τον τομέα της αγοράς διαγνωστικών DNA ως έναν από τους μεγαλύτερους και ταχύτερα αναπτυσσόμενους.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Η ουσία της μεθόδου PCR. DNA πολυμεράση

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας που επιτρέπει σε κάποιον να επιτύχει σημαντική αύξηση σε μικρές συγκεντρώσεις ορισμένων θραυσμάτων νουκλεϊκού οξέος σε βιολογικό υλικό. Αυτή η διαδικασία αύξησης του αριθμού των αντιγράφων του DNA ονομάζεται ενίσχυση. Η αντιγραφή DNA κατά τη διάρκεια της PCR πραγματοποιείται από ένα ειδικό ένζυμο - πολυμεράση.Η DNA πολυμεράση (Εικ. 3) είναι ένα ένζυμο που εμπλέκεται στην αντιγραφή (ενίσχυση του DNA σε ζωντανούς οργανισμούς) του DNA. Ένζυμα αυτής της κατηγορίας καταλύουν τον πολυμερισμό των δεοξυριβονουκλεοτιδίων κατά μήκος μιας αλυσίδας νουκλεοτιδίων DNA, τα οποία το ένζυμο «διαβάζει» και χρησιμοποιεί ως πρότυπο. Ο τύπος ενός νέου νουκλεοτιδίου καθορίζεται από την αρχή της συμπληρωματικότητας με το πρότυπο από το οποίο διαβάζεται.

Η DNA πολυμεράση προσθέτει ελεύθερα νουκλεοτίδια στο άκρο 3" της συναρμολογημένης αλυσίδας. Αυτό οδηγεί σε επιμήκυνση της αλυσίδας προς την κατεύθυνση 5"-3. Καμία από τις γνωστές DNA πολυμεράσες δεν είναι ικανή να δημιουργήσει μια αλυσίδα από την αρχή: μπορούν να προσθέσουν μόνο νουκλεοτίδια σε ήδη υπάρχουσα 3"-υδροξυλομάδα. Για το λόγο αυτό, χρειάζεται DNA πολυμεράση αλφαβητάρι- μια σύντομη αλληλουχία νουκλεοτιδίων (συνήθως 20-25), συμπληρωματικά προς τα τερματικά τμήματα του γονιδίου που μελετάται - στα οποία θα μπορούσε να προσθέσει το πρώτο νουκλεοτίδιο. Οι εκκινητές αποτελούνται πάντα από βάσεις DNA και RNA, με τις δύο πρώτες βάσεις να είναι πάντα βάσεις RNA. Οι εκκινητές συντίθενται από ένα άλλο ένζυμο - primase. Ένα άλλο ένζυμο ελικάση- είναι απαραίτητο για το ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA για να σχηματιστεί μια μονόκλωνη δομή, η οποία εξασφαλίζει την αντιγραφή και των δύο κλώνων σύμφωνα με το ημι-συντηρητικό μοντέλο αντιγραφής του DNA.

Ορισμένες πολυμεράσες DNA έχουν επίσης την ικανότητα να διορθώνουν σφάλματα στον πρόσφατα συναρμολογημένο κλώνο DNA. Εάν ανιχνευθεί ένα εσφαλμένο ζεύγος νουκλεοτιδίων, η πολυμεράση DNA κυλά ένα βήμα προς τα πίσω, εξαλείφει το εσφαλμένο νουκλεοτίδιο από την αλυσίδα και, στη συνέχεια, εισάγει το σωστό στη θέση του, και μετά η αναπαραγωγή συνεχίζεται ως συνήθως.

Διεξαγωγή PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος ενίσχυσης DNA που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA δισεκατομμύρια φορές μέσα σε λίγες ώρες. Η δυνατότητα απόκτησης ενός τεράστιου αριθμού αντιγράφων μιας αυστηρά καθορισμένης περιοχής του γονιδιώματος απλοποιεί σημαντικά τη μελέτη ενός υπάρχοντος δείγματος DNA.

Για να πραγματοποιηθεί μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, πρέπει να πληρούνται ορισμένες προϋποθέσεις. Για να πραγματοποιηθεί PCR στην απλούστερη περίπτωση, απαιτούνται τα ακόλουθα στοιχεία:

Ένα πρότυπο DNA που περιέχει το τμήμα του DNA που πρέπει να ενισχυθεί.

Δύο εκκινητές συμπληρωματικοί προς τα άκρα του επιθυμητού θραύσματος. (Ζεύγος τεχνητά συντιθέμενων ολιγονουκλεοτιδίων, που συνήθως κυμαίνονται σε μέγεθος από 15 έως 30 bp, πανομοιότυπα με τα αντίστοιχα τμήματα του DNA στόχου. Παίζουν βασικό ρόλο στον σχηματισμό προϊόντων αντίδρασης ενίσχυσης. Οι σωστά επιλεγμένοι εκκινητές εξασφαλίζουν την ειδικότητα και την ευαισθησία του το σύστημα δοκιμής.)

Θερμοσταθερή πολυμεράση DNA. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται στην PCR πρέπει να παραμένει ενεργή όταν υψηλή θερμοκρασίαγια μεγάλο χρονικό διάστημα, έτσι χρησιμοποιούν ένζυμα που απομονώνονται από θερμόφιλα - Thermus aquaticus (Taq πολυμεράση) και άλλα.

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ιόντα Mg 2+ απαραίτητα για τη λειτουργία της πολυμεράσης.

Παροχή ρυθμιστικού διαλύματος τις απαραίτητες προϋποθέσειςαντιδράσεις - pH, ιοντική ισχύς του διαλύματος. Περιέχει άλατα, λευκωματίνη ορού.

Για να αποφύγετε την εξάτμιση του μείγματος της αντίδρασης, προσθέστε λάδι υψηλής βρασμού, όπως βαζελίνη, στον δοκιμαστικό σωλήνα. Εάν χρησιμοποιείτε συσκευή με θερμαινόμενο καπάκι, αυτό δεν απαιτείται.

Η προσθήκη πυροφωσφατάσης μπορεί να αυξήσει την απόδοση της αντίδρασης PCR. Αυτό το ένζυμο καταλύει την υδρόλυση του πυροφωσφορικού, ενός υποπροϊόντος της προσθήκης τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων στον αναπτυσσόμενο κλώνο DNA, σε ορθοφωσφορικό. Το πυροφωσφορικό μπορεί να αναστείλει την αντίδραση PCR.

Για να πολλαπλασιαστεί ο αριθμός των αντιγράφων του αρχικού DNA, απαιτείται μια κυκλική αντίδραση. Κατά κανόνα, κάθε ένας από τους διαδοχικά επαναλαμβανόμενους κύκλους PCR αποτελείται από τρία στάδια:

1. Μετουσίωσης, ή «τήξη» του DNA.Το εκμαγείο δίκλωνου DNA θερμαίνεται στους 94 - 96°C (ή στους 98°C εάν χρησιμοποιείται μια ιδιαίτερα θερμοσταθερή πολυμεράση) για 0,5 - 2 λεπτά έτσι ώστε οι κλώνοι του DNA να διαχωριστούν. Αυτό το στάδιο ονομάζεται μετουσίωση επειδή οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων DNA έχουν σπάσει. Μερικές φορές, πριν από τον πρώτο κύκλο (πριν από την προσθήκη της πολυμεράσης), το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2 - 5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως η μήτρα και οι εκκινητές. Αυτή η τεχνική ονομάζεται ζεστό ξεκίνημα, σας επιτρέπει να μειώσετε την ποσότητα των μη ειδικών προϊόντων αντίδρασης.

2. Ανόπτηση - δέσμευση εκκινητών στο DNA εκμαγείου. Μόλις διαχωριστούν οι αλυσίδες, η θερμοκρασία μειώνεται αργά για να επιτρέψει στους εκκινητές να έρθουν σε επαφή με το μονόκλωνο πρότυπο. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τη σύνθεση των ασταριών και συνήθως επιλέγεται στους 50-65°C. Ο χρόνος σταδίου είναι 20 - 60 δευτερόλεπτα. Μια λανθασμένη επιλογή θερμοκρασίας ανόπτησης οδηγεί είτε σε κακή σύνδεση των ασταριών στο εκμαγείο (σε πολύ υψηλή θερμοκρασία) είτε σε δέσιμο σε λάθος μέρος και στην εμφάνιση μη ειδικών προϊόντων (σε πολύ χαμηλή θερμοκρασία).

3. Σύνθεση (επιμήκυνση αλυσίδας).Η DNA πολυμεράση αντιγράφει τον κλώνο του εκμαγείου χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ως εκκινητή. Η πολυμεράση ξεκινά τη σύνθεση του δεύτερου κλώνου από το άκρο 3" του ασταριού, το οποίο έχει συνδεθεί με το εκμαγείο και κινείται κατά μήκος του εκμαγείου. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι πολυμεράσες Taq και Pfu που χρησιμοποιούνται συχνά είναι πιο δραστικές στους 72 Γ. Ο χρόνος σύνθεσης εξαρτάται από τον τύπο της DNA πολυμεράσης και από το μήκος του ενισχυμένου θραύσματος. Συνήθως, ο χρόνος επιμήκυνσης θεωρείται ότι είναι ένα λεπτό ανά χίλια ζεύγη βάσεων. Αφού ολοκληρωθούν όλοι οι κύκλοι, συχνά εκτελείται ένα επιπλέον στάδιο τελική επιμήκυνση, για να συμπληρώσετε όλα τα μονόκλωνα θραύσματα. Αυτό το στάδιο διαρκεί 7 - 10 λεπτά.

Στη συνέχεια, τα στάδια της μετουσίωσης, της ανόπτησης και της επιμήκυνσης επαναλαμβάνονται πολλές φορές (30 ή περισσότερες φορές). Σε κάθε κύκλο, ο αριθμός των συντιθέμενων αντιγράφων ενός θραύσματος DNA διπλασιάζεται.

Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες βυθισμένους σε θερμοστάτη. Η αλλαγή του καθεστώτος θερμοκρασίας και η διατήρησή του πραγματοποιείται αυτόματα.

Για να κατανοήσετε ακριβώς πώς ενισχύεται ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA κατά τη διάρκεια της PCR, πρέπει να φανταστείτε ξεκάθαρα τη θέση όλων των εκκινητών και των συμπληρωματικών τους αλληλουχιών στους ενισχυμένους κλώνους σε κάθε γύρο. Στον πρώτο γύρο, κάθε μία από τις νεοσυντιθέμενες αλυσίδες έχει πολύ μεγαλύτερο μήκος από την απόσταση από την 3"-υδροξυλική ομάδα του εκκινητή της έως το τερματικό νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας συμπληρωματικής του δεύτερου εκκινητή. Τέτοιες αλυσίδες ονομάζονται "μακριές μήτρες". Σε αυτούς θα γίνει περαιτέρω σύνθεση.

Στον δεύτερο γύρο, δίκλωνο DNA, αποτελούμενο από παρόμοιους και πρόσφατα συντεθειμένους (μακριού εκμαγείο) κλώνους, μετουσιώνεται και πάλι και στη συνέχεια ανόπτεται με εκκινητές. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης σε αυτόν τον γύρο, συντίθενται ξανά "μακριές μήτρες", καθώς και ένας αριθμός κλώνων με ένα αστάρι στο ένα άκρο και μια αλληλουχία συμπληρωματική του δεύτερου εκκινητή στο άλλο ("σύντομα πρότυπα"). Κατά τη διάρκεια του τρίτου γύρου, όλα τα ετεροδιπλά που σχηματίστηκαν νωρίτερα μετουσιώνονται ταυτόχρονα και ανόπτονται με εκκινητές και στη συνέχεια αντιγράφονται. Στους επόμενους γύρους, υπάρχουν όλο και περισσότεροι "μικροί πίνακες" και μέχρι τον 30ο γύρο ο αριθμός τους είναι ήδη 10 6 φορές μεγαλύτερος από τον αριθμό των αρχικών αλυσίδων ή "μακριών πινάκων".

Η ποσότητα του ειδικού προϊόντος αντίδρασης (περιορισμένη από εκκινητές) αυξάνεται θεωρητικά αναλογικά με το 2n, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων αντίδρασης. Στην πραγματικότητα, η απόδοση κάθε κύκλου μπορεί να είναι μικρότερη από 100%, οπότε στην πραγματικότητα:

όπου P είναι η ποσότητα του προϊόντος, E είναι η μέση απόδοση του κύκλου.

Ο αριθμός των «μακριών» αντιγράφων DNA αυξάνεται επίσης, αλλά γραμμικά, έτσι ένα συγκεκριμένο θραύσμα κυριαρχεί στα προϊόντα αντίδρασης. Η ανάπτυξη του απαιτούμενου προϊόντος περιορίζεται εκθετικά από τον αριθμό των αντιδραστηρίων, την παρουσία αναστολέων και τον σχηματισμό παραπροϊόντων.

Η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος, επομένως, εάν το δείγμα δοκιμής περιέχει έστω και ασήμαντη ποσότητα DNA που έχει περάσει κατά λάθος από το ένα μείγμα αντίδρασης στο άλλο, μπορούν να ληφθούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Αυτό καθιστά απαραίτητο τον προσεκτικό έλεγχο όλων των διαλυμάτων και των γυαλικών που χρησιμοποιούνται για την PCR.

Βασικές αρχές επιλογής ασταριού.

Κατά τη δημιουργία ενός συστήματος δοκιμής PCR, ένα από τα κύρια καθήκοντα είναι η σωστή επιλογή εκκινητών, τα οποία πρέπει να πληρούν μια σειρά από κριτήρια:

1. Τα αστάρια πρέπει να είναι συγκεκριμένα. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στα άκρα 3" των εκκινητών, καθώς από αυτά αρχίζει η πολυμεράση Taq να συμπληρώνει τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA. Εάν η ειδικότητά τους είναι ανεπαρκής, τότε είναι πιθανό να εμφανιστούν ανεπιθύμητες διεργασίες στον δοκιμαστικό σωλήνα με το μίγμα αντίδρασης, συγκεκριμένα η σύνθεση μη ειδικού DNA (μικρών ή μακριών θραυσμάτων). Είναι ορατό στην ηλεκτροφόρηση με τη μορφή βαριών ή ελαφρών πρόσθετων ζωνών. Αυτό παρεμποδίζει την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης, καθώς είναι εύκολο να συγχέουμε τα συγκεκριμένα προϊόν ενίσχυσης με συντιθέμενο ξένο DNA Ορισμένοι εκκινητές και dNTP δαπανώνται για τη σύνθεση μη ειδικού DNA, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική απώλεια ευαισθησίας.

2. Τα αστάρια δεν πρέπει να σχηματίζουν διμερή και βρόχους, δηλ. δεν πρέπει να σχηματίζονται σταθεροί διπλοί κλώνοι ως αποτέλεσμα της ανόπτησης των ασταριών μεταξύ τους ή μεταξύ τους.