Metode de transfecție genetică în terapia genică. Fundamentele terapiei moleculare

Sănătate

Conceptul de înlocuire a genelor defecte cu gene sănătoase, care a început să dobândească în mod activ un înveliș științific la începutul anilor nouăzeci ai secolului trecut părea să dea speranță celor mai deznădăjduiți pacienți. Cu toate acestea, de la primul experiment de terapie genetică, efectuat în 1990, optimismul în rândul oamenilor de știință a scăzut oarecum - și totul din cauza anumitor eșecuri și dificultăți în implementarea metodelor de terapie genetică. Cu toate acestea, posibilitățile oferite de terapia genică pentru tratamentul bolii Parkinson, fibrozei chistice, diferite feluri cancerul și multe alte boli sunt cu adevărat nelimitate. De aceea oamenii de știință lucrează neobositîncercând să depășească toate dificultățile care apar în calea lor asociate cu terapia genică.

Ce este terapia genică?

Deci, ce este mai exact terapia genică? Pentru a răspunde la această întrebare, este necesar să ne amintim că funcția principală a genelor din corpul nostru este de a regla producția de proteine necesare pentru funcționarea normală și sănătatea tuturor celulelor. Dar unele defecte genetice (defecte ale genelor) interferează cu funcția lor principală, într-o măsură sau alta, împiedicând producerea de proteine. Scopul terapiei genice (terapia genică) este înlocuirea genelor defecte cu unele sănătoase. Acest lucru va ajuta la stabilirea reproducerii proteinei corespunzătoare, ceea ce înseamnă că o persoană va fi vindecată de o anumită boală.

Având în vedere scenariul ideal de dezvoltare, celulele cu molecule ajustate de acid dezoxiribonucleic (ADN) va începe să se dividă, producând, la rândul său, mai multe copii ale genei corectate, ceea ce va permite organismului să scape de anomalia genetică și să se vindece complet. Cu toate acestea, introducerea genelor sănătoase în celulele bolnave (precum și încercările de a corecta abaterile corespunzătoare) este un proces extrem de complex, care până acum rar a avut succes.. De aceea, majoritatea cercetărilor moderne vizează dezvoltarea unor mecanisme sigure și fiabile pentru introducerea genelor în celulele deteriorate.

Tipuri de terapie genică: terapie ex vivo și in vivo

Terapia genică, în funcție de metoda de introducere a ADN-ului în genomul pacientului, poate fi efectuată fie în cultură celulară (ex vivo), fie direct în organism (in vivo). În cazul terapiei genice ex vivo, celulele sunt îndepărtate din corpul pacientului, modificate genetic și apoi reintroduse înapoi în corpul individului. Această metodă este utilă în special în tratamentul tulburărilor de sânge, deoarece celulele sanguine pot fi îndepărtate și repuse destul de ușor. Cu toate acestea, în cazul majorității celorlalte boli, îndepărtarea celulelor din organism și reintroducerea lor este departe de a fi ușoară. De exemplu, în cazul bolilor de inimă din cauze genetice, o măsură eficientă este așa-numita terapie genică in vivo, atunci când modificările genelor sunt efectuate direct în corpul pacientului. Pentru a face această procedură, informațiile genetice sunt livrate direct în celulă prin intermediul unui vector - o moleculă de acid nucleic, utilizate în inginerie genetică pentru a transfera material genetic. În cele mai multe cazuri, pentru a realiza această transmitere, cercetătorii folosesc viruși care nu sunt periculoși pentru sănătate și viață.

Metode pentru furnizarea de informații genetice în celulă

Numeroase studii arată că utilizarea diverșilor viruși este o soluție foarte eficientă, care vă permite să treceți prin apărarea imunitară a organismuluiși apoi infectați celulele, folosindu-le pentru a răspândi virusul. Pentru a efectua această procedură, inginerii genetici au selectat cele mai potrivite viruși din grupul de retrovirusuri și adenovirusuri. Retrovirusurile aduc informații genetice sub formă de acid ribonucleic (ARN), o moleculă asemănătoare ADN-ului care ajută la procesarea informațiilor genetice stocate în ADN. De îndată ce este posibil să pătrundă adânc în așa-numita celulă țintă, se obține o copie a moleculei de ADN din molecula de ARN. Acest proces se numește transcriere inversă. Odată ce o nouă moleculă de ADN este atașată la o celulă, toate copiile noi ale celulei vor conține acea genă modificată.

Adenovirusurile transportă imediat informații genetice sub formă de ADN, care este livrat unei celule care nu se divide. Cu toate că acești virusuri furnizează ADN direct în nucleul celulei țintă ADN-ul nu se potrivește în genomul celulei. Astfel, gena modificată și informațiile genetice nu sunt transmise celulelor fiice. Avantajul terapiei genice efectuate folosind adenovirusuri este că este posibilă introducerea genelor în celulele sistemului nervos și în membrana mucoasă. tractului respirator, din nou, prin intermediul unui vector. În plus, există o a treia metodă de terapie genică, realizată prin așa-numitele virusuri adeno-asociate. Acești viruși conțin cantitate relativ mică de informații geneticeși sunt mult mai greu de eliminat decât retrovirusurile și adenovirusurile. Cu toate acestea, avantajul virusurilor adeno-asociate este că nu provoacă o reacție sistem imunitar persoană.

Dificultăți în utilizarea virușilor în terapia genică

Principala problemă asociată cu metoda de livrare a informațiilor genetice în celulă prin intermediul virușilor este aceea este extrem de dificil să controlezi complet conexiunea genelor cu o celulă țintă. Acest lucru poate fi extrem de periculos, deoarece așa-numita expresie a genelor, care poate transforma celulele sănătoase în celule canceroase, nu este exclusă. În acest moment, această problemă este deosebit de relevantă în tratarea retrovirusurilor. A doua problemă a cărei soluţie nu este încă posibil de organizat, constă în faptul că o singură procedură pentru utilizarea terapiei genice, cel mai adesea, nu este suficientă. Majoritatea terapiilor genetice trebuie repetate din când în când. Și, în al treilea rând, utilizarea virușilor pentru a furniza informații genetice într-o celulă este complicată de riscul unei reacții a sistemului imunitar al organismului. Aceasta este, de asemenea, o problemă extrem de gravă, mai ales în cazurile în care când este necesară repetarea repetată a procedurii de terapie genică, pe măsură ce organismul pacientului se adaptează treptat și începe să lupte cu virusurile injectate din ce în ce mai eficient.

Terapia genică: Cercetările continuă

Dacă vorbim despre succes, atunci, în acest moment, terapia genetică este o măsură extrem de eficientă. în tratamentul așa-numitei imunodeficiențe combinate, legat de gena cromozomului X. Pe de altă parte, există foarte puține cazuri de utilizare cu succes a terapiei genice pentru tratamentul acestei boli. În plus, tratamentul în sine este o întreprindere riscantă, deoarece poate provoca o serie de simptome la pacienții care se găsesc la persoanele care suferă de leucemie. În afară de această boală, există foarte, foarte puține cazuri de utilizare a terapiei genice care ar fi la fel de eficiente, deși studiile recente dau speranță pentru utilizarea timpurie a terapiei genice pentru tratamentul pacienților care suferă de artrită, cancer cerebral, anemie falciforme, despicatură retiniană și alte afecțiuni.

Se pare că este prea devreme să vorbim despre aplicarea practică a terapiei genice în medicină. In orice caz, cercetătorii continuă să caute modalități de a utiliza terapia genică în siguranță și eficient, după ce a efectuat majoritatea experimentelor în țesutul viu transferat din corp într-un mediu extern artificial. Printre aceste experimente, studiile în care oamenii de știință încearcă să introducă un cromozom artificial, al 47-lea, într-o celulă țintă, sunt extrem de interesante. Descoperirile științifice recente au permis oamenilor de știință să înțeleagă mai bine procesele care apar în timpul introducerii unei molecule de ARN. Acest lucru a condus la dezvoltarea unui mecanism de suprimare a transcripției genelor (așa-numita gene knockout), care poate fi benefică în tratamentul bolii Hamilton. Oamenii de știință raportează, de asemenea, că au reușit să dezvolte o modalitate de a furniza informații genetice celulelor creierului, ceea ce anterior nu putea fi făcut folosind un vector. întrucât această moleculă era prea mare pentru acest scop. Cu alte cuvinte, cercetările continuă, ceea ce înseamnă că omenirea are toate șansele să învețe cum să lupte împotriva bolilor prin utilizarea metodelor de terapie genetică.

14943 0

Stabilirea locației și secvenței unei gene ale cărei mutații provoacă boli specifice, precum și mutația în sine și moduri moderne testarea sa face posibilă diagnosticarea bolii în perioada neo- și chiar prenatală de dezvoltare a organismului. Acest lucru face posibilă atenuarea manifestării unui defect genetic cu ajutorul tratamentului medicamentos, alimentației, transfuziei de sânge etc.

Cu toate acestea, această abordare nu duce la corectarea defectului în sine și, de regulă, bolile ereditare nu pot fi vindecate. Situația este și mai complicată de faptul că mutația unei gene poate avea o varietate de consecințe asupra organismului. Dacă o mutație genetică provoacă modificări ale activității enzimei pe care o codifică, atunci aceasta poate duce la acumularea unui substrat toxic sau, dimpotrivă, la o deficiență a unui compus necesar pentru funcționarea normală a celulei.

Un exemplu binecunoscut al unei astfel de boli este fenilcetonuria. Este cauzată de o mutație a genei pentru enzima hepatică fenilalanin dehidroxilază, care catalizează conversia fenilalaninei în tirozină. Ca urmare, nivelul fenilalaninei endogene din sânge crește, ceea ce provoacă formarea necorespunzătoare a tecii de mielină din jurul axonilor. celule nervoase sistemul nervos central și, în consecință, retard mintal sever.

Dacă mutația afectează gena proteinei structurale, atunci aceasta poate duce la tulburări grave la nivelul celulelor, țesuturilor sau organelor. Un exemplu de astfel de boală este fibroza chistică.

O deleție a genei care codifică o proteină numită transportor de fibroză chistică duce la sinteza unei proteine ​​defecte (absența fenilalaninei 508) și la deteriorarea transportului ionilor de clorură prin membranele celulare. Unul dintre cele mai dăunătoare efecte ale acestui lucru este că mucusul care căptușește și protejează plămânii devine anormal de gros. Acest lucru îngreunează accesul la celulele plămânilor și contribuie la acumularea de microorganisme dăunătoare. Celulele care căptușesc căile respiratorii ale plămânilor mor și sunt înlocuite cu țesut cicatricial fibros (de unde și numele bolii). Ca urmare, pacientul moare din cauza insuficienței respiratorii.

Bolile ereditare sunt complexe manifestari clinice, iar tratamentul lor tradițional este în principal simptomatic: pentru tratamentul fenilcetonuriei se prescrie o dietă fără alanină, proteinele defecte sunt înlocuite cu altele funcționale. administrare intravenoasă, pentru a compensa funcțiile pierdute, măduva osoasă sau alte organe sunt transplantate. Toate aceste măsuri, de regulă, sunt ineficiente, costisitoare, pe termen lung și doar câțiva pacienți trăiesc până la bătrânețe. Prin urmare, dezvoltarea unor tipuri fundamental noi de terapie este foarte importantă.

Terapia genică

În 1990, în SUA, dr. W. French Andrson a făcut prima încercare de terapie genică pentru tratamentul imunodeficienței severe combinate (SCID) la o fetiță de trei ani, Ashanti de Silva. Această boală este cauzată de o mutație a genei care codifică adenosanadenilaza (ADA). Deficiența acestei enzime contribuie la acumularea de adenozină și deoxiadenozină în sânge, efect toxic ceea ce duce la moartea limfocitelor B și T sânge periferic si in consecinta imunodeficienta.

Copiii cu o astfel de boală trebuie protejați de orice infecții (a se păstra în celule sterile speciale), deoarece orice boală poate fi fatală. La 4 ani de la începerea tratamentului, copilul a arătat expresia unui ADA care funcționează normal și ameliorarea simptomelor SCID, ceea ce i-a permis să părăsească camera sterilă și să ducă o viață normală.

Astfel, a fost demonstrată posibilitatea fundamentală a terapiei genetice de succes a celulelor somatice. Din anii 90. sunt supuși unor studii de terapie genică pentru o serie de boli genetice, inclusiv cele severe precum hemofilia, SIDA, tipuri diferite neoplasme maligne, fibroza chistica etc. In prezent, cu ajutorul transgenezei se pot vindeca aproximativ 10 boli umane.

Diversitatea bolilor genetice a predeterminat dezvoltarea multor abordări ale terapiei genice. În acest caz, sunt rezolvate 2 probleme principale: un mijloc de eliberare a unei gene terapeutice; o metodă pentru furnizarea de livrare țintită la celulele destinate corecției. Până în prezent, toate abordările de terapie genetică a celulelor somatice pot fi împărțite în două categorii: terapia ex vivo și terapia in vivo (Fig. 3.15).

Orez. 3.15. Schema terapiei genice ex vivo (a) și in vivo (a)

Terapia genică in vivo implică livrarea unei gene terapeutice direct în celulele unui țesut specific pacientului. Să luăm în considerare aceste abordări mai detaliat.

Terapia genică ex vivo include următorii pași:
1) obținerea celulelor defecte ale pacientului și cultivarea acestora;
2) transferul genei dorite în celule izolate prin transfecţia unui construct genic terapeutic;
3) selecția și creșterea celulelor corectate genetic;
4) transplantul sau transfuzia acestor celule la pacient.

Utilizarea celulelor proprii ale pacientului asigură că, odată ce sunt returnate, pacientul nu dezvoltă un răspuns imun. Procedura de transfer al constructului genic trebuie să fie eficientă, iar gena normală trebuie menținută stabil și exprimată continuu.

Mijloacele de transfer a genelor create de natura însăși sunt viruși. Pentru a obține vectori eficienți pentru livrarea genelor, se folosesc în principal două grupe de viruși - adenovirusuri și retrovirusuri (Fig. 3.16). În terapia genică se folosesc variante de virusuri neutralizate genetic.

Orez. 3.16. Virușii utilizați pentru a crea vectori terapeutici

Orez. 3.17. Harta genetică a unui retrovirus tipic (a) și harta vectorului retroviral (a)

La primirea unui vector retroviral, ADN-ul de lungime completă al retrovirusului este inserat în plasmidă, cea mai mare parte a genei gag este îndepărtată și genele pol și env sunt complet îndepărtate, iar în locul lor, gena T „terapeutică” și , dacă este necesar, se inserează gena Rg selectivă a markerului cu propriul său promotor (Fig. 3.17, b). Transcripția genei T va fi controlată de același promotor puternic localizat în regiunea 5'-LTR Pe baza acestei scheme, au fost creați diverși vectori retrovirali și dimensiunea maximă a inserției de ADN de aproximativ 8 kb.

Construcția astfel obținută poate fi utilizată de la sine pentru transformare, dar eficiența sa și integrarea ulterioară în genomul celulei gazdă este extrem de scăzută. Prin urmare, a fost dezvoltată o tehnică pentru ambalarea ARN-ului vector retroviral de lungime completă în particule virale intacte, care frecventa inalta pătrund în celulă și sunt garantate a fi integrate în genomul gazdei. Pentru aceasta, a fost creată o așa-numită linie celulară „de ambalare”. În două părți diferite ale cromozomilor acestor celule sunt cusute genele retrovirale gag și pol-env, lipsite de capacitatea de împachetare din cauza lipsei secvenței + (84*+) (Fig. 3.18).

Orez. 3.18. Schemă pentru obținerea unui vector viral ambalat

Retrovirusurile infectează în mod activ doar celulele cu diviziune rapidă. Pentru transferul de gene, acestea sunt tratate cu particule de vector retroviral ambalate purificate sau co-cultivate cu o linie celulară care le produce și apoi selectate pentru a separa celulele țintă și cele de ambalare.

Celulele transduse sunt verificate cu atenție pentru nivelul de sinteză a produsului genetic terapeutic, absența retrovirusurilor competente pentru replicare, absența modificărilor în capacitatea celulelor de a crește sau de a funcționa.

Cele mai potrivite pentru terapia genică sunt celulele măduvei osoase. Acest lucru se datorează prezenței în el a celulelor stem embrionare totipotente, care pot prolifera și se pot diferenția în Tipuri variate celule - limfocite B și T, macrofage, eritrocite, trombocite și osteoclaste. Aceste celule sunt folosite pentru a trata o serie de boli ereditare, printre care deja menționate imunodeficiența combinată severă, boala Gaucher, anemia falciformă, talasemia, osteoporoza etc.

Pe lângă celulele stem totipotente din măduva osoasă, care sunt greu de izolat și de cultivat, sunt folosite celule stem din sângele ombilical (utilizarea preferată pentru terapia genică neonatală), precum și celule hepatice - hepatocite - pentru tratamentul hipercolesterolemiei.

În terapia genică in vivo, este deosebit de important să se asigure livrarea genei terapeutice către celulele defecte. O astfel de livrare țintită poate fi furnizată de vectori modificați bazați pe viruși capabili să infecteze tipuri specifice de celule. Luați în considerare abordarea dezvoltată pentru tratamentul fibrozei chistice deja menționată mai sus. Deoarece plămânii sunt o cavitate deschisă, este relativ ușor să le livrezi gene terapeutice. O variantă donată a genei sănătoase a fost introdusă într-un adenovirus inactivat (Fig. 3.19). Specificul acestui tip de virus este că infectează mucoasa plămânilor, provocând o răceală.

Orez. 3.19. Schema de obtinere a unui vector bazat pe adenovirus

Pe lângă retro- și adenovirusuri, în experimentele de terapie genetică sunt utilizate și alte tipuri de virusuri, cum ar fi virusul Herpes simplex. O caracteristică a acestui virus ADN dublu catenar (152 kb) este capacitatea sa de a infecta în mod specific neuronii. Există multe boli genetice cunoscute care afectează central și periferic sistem nervos- tumori, tulburari metabolice, boli neurodegenerative (boala Alzheimer, boala Parkinson).

Virus herpes simplex Tipul I (HSV) este un vector foarte potrivit pentru terapia unor astfel de boli. Capsida acestui virus fuzionează cu membrana neuronului și ADN-ul acestuia este transportat către nucleu. Au fost propuse mai multe metode pentru transferul unei gene terapeutice folosind vectori HSV și au fost efectuate teste de succes pe animale de experiment.

Vectorii virali au mai multe dezavantaje: cost ridicat, capacitate de clonare limitată și posibil răspuns inflamator. Așadar, în 1999, ca urmare a unui răspuns imun neobișnuit de puternic la introducerea unui vector adenoviral, a murit un voluntar de 18 ani care a luat parte la studiile de droguri. În 2002, doi copii din Franța au dezvoltat o afecțiune asemănătoare leucemiei în timpul tratamentului pentru imunodeficiență (prin introducerea de gene terapeutice în celulele stem folosind retrovirusuri).

Prin urmare, sunt dezvoltate sisteme de livrare a genelor non-virale. Cea mai simplă și ineficientă modalitate este de a injecta ADN plasmid în țesuturi. A doua abordare este bombardarea țesuturilor cu microparticule de aur (1-3 µm) conjugate cu ADN. În acest caz, genele terapeutice sunt exprimate în țesuturile țintă, iar produsele lor - proteinele terapeutice - intră în fluxul sanguin. Principalul dezavantaj al acestei abordări este inactivarea sau distrugerea prematură a acestor proteine ​​de către componentele sanguine.

ADN-ul poate fi livrat prin ambalarea lui într-o înveliș lipidic artificial. Particulele sferice-lipozomi obținute astfel pătrund ușor în membrana celulară. Au fost creați lipozomi cu o varietate de proprietăți, dar până acum eficiența unei astfel de livrări este scăzută, de atunci majoritatea ADN-ul suferă degradare lizozomală. De asemenea, pentru a furniza un construct genetic, conjugatele ADN sunt sintetizate cu diverse molecule care pot asigura siguranța acestuia, livrarea țintită și penetrarea celulară.

În ultimii ani, au fost efectuate experimente intensive pentru a crea un cromozom al 47-lea artificial, care ar permite includerea unei cantități mari de material genetic cu un set complet de elemente de reglare pentru una sau mai multe gene terapeutice. Acest lucru ar face posibilă utilizarea unei variante genomice a genei terapeutice și, prin urmare, ar asigura stabilitatea și expresia eficientă pe termen lung a acesteia. Experimentele efectuate au arătat că crearea unui cromozom uman artificial care conține gene terapeutice este destul de realistă, dar încă nu este clar cum să se introducă o moleculă atât de uriașă în nucleul unei celule țintă.

Principalele probleme cu care se confruntă terapia genică, pe lângă riscul unei reacții imune severe, sunt dificultățile de stocare și funcționare pe termen lung a ADN-ului terapeutic în organismul pacientului, multigenicitatea multor boli, ceea ce le face o țintă dificilă pentru gene. terapie și riscul utilizării virușilor ca vectori.

PE. Voinov, T.G. Volova

Introducere

În fiecare an apar tot mai multe articole în reviste științifice despre studii clinice medicale, în care, într-un fel sau altul, s-a folosit un tratament bazat pe introducerea diverselor gene - terapia genică. Această direcție a crescut din ramuri atât de bine dezvoltate ale biologiei precum genetica moleculară și biotehnologia.

Adesea, atunci când metodele convenționale (conservatoare) au fost deja încercate, terapia genică este cea care poate ajuta pacienții să supraviețuiască și chiar să se recupereze complet. De exemplu, acest lucru se aplică bolilor monogenice ereditare, adică cele cauzate de un defect la o singură genă, precum și multe altele. Sau, de exemplu, terapia genică poate ajuta și salva un membru pentru acei pacienți care au un lumen vascular îngust în membrele inferioareși ca rezultat, s-a dezvoltat ischemia persistentă a țesuturilor înconjurătoare, adică aceste țesuturi sunt sever deficitare nutriențiși oxigen, care sunt transportate în mod normal de sânge în tot organismul. Este adesea imposibil să se trateze astfel de pacienți cu manipulări chirurgicale și medicamente, dar dacă celulele sunt forțate local să arunce mai mulți factori proteici care ar afecta procesul de formare și germinare a noilor vase, atunci ischemia ar deveni mult mai puțin pronunțată și ar deveni mult mai ușor de trăit pentru pacienți.

terapia genică astăzi poate fi definit ca tratamentul bolilor prin introducerea de gene în celulele pacienților cu scopul de a viza defectele genelor sau de a conferi celulelor noi funcții. Primele studii clinice ale metodelor de terapie genetică au fost întreprinse chiar în 22 mai 1989 pentru a diagnostica cancerul. Primul boala ereditara, pentru care s-au aplicat metode de terapie genică, s-a dovedit a fi imunodeficiență ereditară.

În fiecare an, numărul de studii clinice efectuate cu succes de tratament diverse boli cu utilizarea terapiei genice este în creștere, iar până în ianuarie 2014 a ajuns la 2 mii.

În același timp, în cercetările moderne privind terapia genică, trebuie să se țină cont de faptul că consecințele manipulării genelor sau ADN-ului „amestecat” (recombinant) in vivo(lat. literalmente „în viață”) nu au fost suficient studiate. În țările cu cel mai avansat nivel de cercetare în acest domeniu, în special în Statele Unite ale Americii, protocoalele medicale care utilizează secvențele ADN-ului sens sunt supuse examinării obligatorii în cadrul comitetelor și comisiilor relevante. În SUA, acestea sunt Comitetul consultativ pentru ADN recombinant (RAC) și Food and Drug Administration (FDA), cu aprobarea ulterioară obligatorie a proiectului de către directorul National Institutes of Health (National Institutes of Health).

Deci, am decis că acest tratament se bazează pe faptul că, dacă unor țesuturi ale corpului le lipsesc unii factori proteici individuali, atunci acest lucru poate fi corectat prin introducerea genelor adecvate care codifică proteinele în aceste țesuturi și totul va deveni mai mult sau mai puțin minunat. . Nu va fi posibil să introducem proteine ​​în sine, deoarece organismul nostru va reacționa imediat răspunsul imun, iar durata acțiunii ar fi insuficientă. Acum trebuie să decidem asupra metodei de livrare a genei în celule.

Transfectarea celule

Pentru început, merită să introduceți definiții ale unor termeni.

Transportul genelor este realizat de vector este o moleculă de ADN folosită ca " vehicul» pentru transferul artificial de informații genetice în celulă. Există multe tipuri de vectori: plasmidi, virali, precum și cosmide, fasmide, cromozomi artificiali etc. Este de o importanță fundamentală ca vectorii (în special, vectorii plasmidii) să aibă proprietățile lor caracteristice:

1. Originea replicării (ori)- secvența de nucleotide la care începe duplicarea ADN-ului. Dacă ADN-ul vector nu se poate duplica (replica), atunci este necesar efect de vindecare nu se va realiza, deoarece va fi pur și simplu scindată rapid de enzimele nucleaze intracelulare și, din cauza lipsei șabloanelor, se vor forma în cele din urmă mult mai puține molecule de proteine. Trebuie menționat că aceste puncte sunt specifice fiecărei specii biologice, adică dacă ADN-ul vector se presupune a fi obținut prin reproducerea sa într-o cultură bacteriană (și nu doar sinteza chimica, care este de obicei mult mai scump), atunci vor fi necesare două origini separate de replicare - pentru oameni și pentru bacterii;

2. Site-uri de restricții- secvențe scurte specifice (de obicei palindromice), care sunt recunoscute de enzime speciale (endonucleaze de restricție) și sunt tăiate de acestea într-un anumit fel - cu formarea de „capete lipicioase” (Fig. 1).

Fig.1 Formarea „capetelor lipicioase” cu participarea restrictazelor

Aceste situsuri sunt necesare pentru a lega vectorul ADN (care, de fapt, este un „martor”) cu genele terapeutice dorite într-o singură moleculă. O astfel de moleculă reticulată din două sau mai multe părți este numită „recombinantă”;

3. Este clar că am dori să obținem milioane de copii ale moleculei de ADN recombinat. Din nou, dacă avem de-a face cu o cultură de celule bacteriene, atunci acest ADN trebuie izolat în continuare. Problema este că nu toate bacteriile vor înghiți molecula de care avem nevoie, unele nu. Pentru a distinge între aceste două grupuri, acestea sunt inserate în ADN-ul vector markeri selectivi- zone de rezistenţă la anumite chimicale; acum, dacă aceleași substanțe sunt adăugate în mediu, atunci doar cele care sunt rezistente la ele vor supraviețui, iar restul vor muri.

Toate aceste trei componente pot fi observate în prima plasmidă sintetizată artificial (Fig. 2).

Fig.2

Însuși procesul de introducere a unui vector plasmid în anumite celule este numit transfecție. O plasmidă este o moleculă de ADN destul de scurtă și de obicei circulară care se găsește în citoplasma unei celule bacteriene. Plasmidele nu sunt asociate cu cromozomul bacterian, se pot replica independent de acesta, ele pot fi aruncate de bacterie în mediu inconjurator sau, dimpotrivă, să fie absorbită (procesul de absorbție - transformare). Cu ajutorul plasmidelor, bacteriile pot face schimb de informații genetice, de exemplu, pot transfera rezistența la anumite antibiotice.

Plasmidele există în bacterii in vivo. Dar nimeni nu poate împiedica un cercetător să sintetizeze artificial o plasmidă care va avea proprietățile de care are nevoie, să coasă o genă inserată în ea și să o introducă într-o celulă. În aceeași plasmidă pot fi introduse diferite inserții .

Metode de terapie genică

Există două abordări principale care diferă prin natura celulelor țintă:

1. Fetal, în care ADN străin este introdus în zigot (oul fertilizat) sau embrion pe stadiu timpuriu dezvoltare; în acest caz, este de așteptat ca materialul introdus să intre în toate celulele primitorului (și chiar celulele germinale, asigurând astfel transmiterea către generația următoare). La noi, de fapt, este interzis;

2. Somatic, în care materialul genetic este introdus în celulele non-sex ale celui deja născut și nu este transmis celulelor germinale.

Terapia genică in vivo se bazează pe introducerea directă a secvențelor de ADN clonate (multiplicate) și ambalate specific în anumite țesuturi ale pacientului. Deosebit de promițătoare pentru tratamentul bolilor genetice in vivo este introducerea de gene folosind aerosoli sau vaccinuri injectabile. Terapia genică cu aerosoli este în curs de dezvoltare, de regulă, pentru tratamentul bolilor pulmonare (fibroză chistică, cancer pulmonar).

Dezvoltarea unui program de terapie genetică este precedată de mai multe etape. Aceasta include o analiză amănunțită a expresiei specifice țesutului a genei corespunzătoare (adică sinteza pe matricea genică a unei proteine ​​dintr-un anumit țesut) și identificarea defectului biochimic primar și studiul structurii, funcției și distribuția intracelulară a produsului său proteic, precum și analiza biochimică proces patologic. Toate aceste date sunt luate în considerare la întocmirea protocolului medical corespunzător.

Este important ca atunci când se elaborează scheme de corecție a genelor, eficiența transfecției, gradul de corectare a defectului biochimic primar în condiții de cultură celulară ( in vitro,„in vitro”) și, cel mai important, in vivo pe modele biologice animale. Abia atunci poate începe programul de studii clinice. .

Livrarea directă și purtătorii celulari ai genelor terapeutice

Există multe metode de introducere a ADN-ului străin într-o celulă eucariotă: unele depind de procesarea fizică (electroporare, magnetofecție etc.), altele de aplicare. materiale chimice sau particule biologice (de exemplu viruși) care sunt utilizate ca purtători. Merită menționat imediat că metodele chimice și fizice sunt de obicei combinate (de exemplu, electroporare + învelire ADN cu lipozomi)

Metode directe

1. Transfecția pe bază de substanțe chimice poate fi clasificată în mai multe tipuri: folosind substanță ciclodextrină, polimeri, lipozomi sau nanoparticule (cu sau fără funcționalizare chimică sau virală, adică modificarea suprafeței).
a) Una dintre cele mai ieftine metode este utilizarea fosfatului de calciu. Mărește eficiența încorporării ADN-ului în celule de 10-100 de ori. ADN-ul formează un complex puternic cu calciul, care asigură absorbția eficientă a acestuia. Dezavantajul este că doar aproximativ 1 - 10% din ADN ajunge în nucleu. Metoda folosita in vitro pentru a transfera ADN în celule umane (Fig. 3);

Fig.3

b) Utilizarea de molecule organice foarte ramificate - dendrimer, pentru a lega ADN-ul și a-l transfera în celulă (Fig. 4);

Fig.4

c) O metodă foarte eficientă pentru transfecția ADN-ului este introducerea acestuia prin lipozomi - corpuri mici, înconjurate de membrană, care pot fuziona cu membrana citoplasmatică celulară (CPM), care este un strat dublu de lipide. Pentru celulele eucariote, transfecția este mai eficientă cu lipozomii cationici, deoarece celulele sunt mai sensibile la aceștia. Procesul are propriul nume - lipofecție. Această metodă este considerată una dintre cele mai sigure astăzi. Lipozomii sunt non-toxici și non-imunogene. Cu toate acestea, eficiența transferului de gene folosind lipozomi este limitată, deoarece ADN-ul introdus de aceștia în celule este de obicei capturat imediat de lizozomi și distrus. Introducerea ADN-ului în celulele umane cu ajutorul lipozomilor este pilonul terapiei de astăzi. in vivo(fig.5);

Fig.5

d) O altă metodă este utilizarea polimerilor cationici precum dietilaminoetil-dextran sau polietilenimina. Moleculele de ADN încărcate negativ se leagă de policationi încărcați pozitiv, iar acest complex intră apoi în celulă prin endocitoză. Modificări DEAE-dextran proprietăți fizice membrana plasmatică și stimulează absorbția acestui complex de către celulă. Principalul dezavantaj al metodei este că DEAE-dextran în concentratii mari toxic. Metoda nu a primit distribuție în terapia genică;

e) Cu ajutorul histonelor şi a altor proteine ​​nucleare. Aceste proteine, care conțin mulți aminoacizi încărcați pozitiv (Lys, Arg), în condiții naturale ajută la împachetarea compactă a unui lanț lung de ADN într-un nucleu celular relativ mic.

2. Metode fizice:

a) Electroporarea este o metodă foarte populară; creșterea instantanee a permeabilității membranei se realizează datorită faptului că celulele sunt supuse unor expuneri scurte la un câmp electric intens. S-a demonstrat că în condiții optime numărul de transformanți poate ajunge la 80% din celulele supraviețuitoare. În prezent, nu este utilizat la oameni (Fig. 6).

Fig.6

b) „Strângerea celulelor” – o metodă inventată în 2013. Vă permite să livrați molecule către celule prin „strângerea moale” a membranei celulare. Metoda elimină posibilitatea de toxicitate sau lovire greșită asupra țintei, deoarece nu depinde de materiale externe sau câmpuri electrice;

c) Sonoporare - o metodă de transfer artificial al ADN-ului străin în celule prin expunerea acestora la ultrasunete, care determină deschiderea porilor în membrana celulară;
d) Transfecția optică - o metodă prin care se face o gaură minusculă în membrană (aproximativ 1 µm în diametru) folosind un laser foarte focalizat;
e) Transfecția hidrodinamică - o metodă de eliberare a constructelor genetice, proteinelor etc. printr-o creștere controlată a presiunii în capilare și lichid interstițial, ceea ce determină o creștere pe termen scurt a permeabilității membranelor celulare și formarea de pori temporari în acestea. Se efectuează prin injectare rapidă în țesut, în timp ce livrarea este nespecifică. Eficiența de livrare pentru mușchiul scheletic - 22 până la 60% ;

f) Microinjecție de ADN - introducere în nucleul celulelor animale folosind microtubuli subțiri de sticlă (d=0,1-0,5 µm). Dezavantajul este complexitatea metodei, probabilitatea de distrugere a nucleului sau ADN-ului este mare; un număr limitat de celule poate fi transformat. Nu este folosit pentru oameni.

3. Metode bazate pe particule.

a) O abordare directă a transfecției este pistolul de gene, în care ADN-ul este cuplat într-o nanoparticulă cu solide inerte (de obicei aur, wolfram), care apoi „trage” îndreptat către nucleele celulelor țintă. Se aplică această metodă in vitroși in vivo pentru introducerea de gene, în special, în celulele țesuturilor musculare, de exemplu, într-o boală precum distrofia musculară Duchenne. Dimensiunea particulelor de aur este de 1-3 microni (Fig. 7).

Fig.7

b) Magnetofectie - o metoda care foloseste fortele magnetismului pentru a livra ADN celulelor tinta. În primul rând, acizii nucleici (NA) sunt asociați cu nanoparticule magnetice, iar apoi, sub acțiunea unui câmp magnetic, particulele sunt conduse în celulă. Eficiența este de aproape 100%, se observă o nontoxicitate evidentă. Deja după 10-15 minute, particulele sunt înregistrate în celulă - aceasta este mult mai rapidă decât alte metode.
c) Impalefectie (impalefection; "impalment", lit. "impaling" + "infectie") - o metodă de livrare care utilizează nanomateriale precum nanotuburi de carbon și nanofibre. În acest caz, celulele sunt literalmente străpunse de un strat de nanofibrile. Prefixul „nano” este folosit pentru a desemna dimensiunile lor foarte mici (în limita a miliardelor de metru) (Fig. 8).

Fig.8

Separat, merită evidențiată o astfel de metodă precum transfecția ARN: nu ADN-ul este livrat celulei, ci moleculele de ARN - „succesorii” lor în lanțul de biosinteză a proteinelor; în același timp, sunt activate proteine ​​speciale care taie ARN-ul în fragmente scurte - așa-numitele. ARN interferent mic (siARN). Aceste fragmente se leagă de alte proteine ​​și, în cele din urmă, aceasta duce la inhibarea expresiei genelor corespunzătoare de către celulă. Astfel, este posibil să blocăm acțiunea acelor gene din celulă care pot face mai mult rău decât bine în acest moment. Transfecția ARN și-a găsit o aplicație largă, în special, în oncologie.

Sunt luate în considerare principiile de bază ale eliberării genelor folosind vectori plasmidici. Acum putem trece la luarea în considerare a metodelor virale. Virușii sunt forme de viață necelulare, cel mai adesea o moleculă de acid nucleic (ADN sau ARN) învelită într-un înveliș proteic. Dacă tăiem din materialul genetic al virusului toate acele secvențe care provoacă apariția bolilor, atunci întregul virus poate fi, de asemenea, transformat cu succes într-un „vehicul” pentru gena noastră.

Procesul de introducere a ADN-ului într-o celulă, mediat de un virus, se numește transducție.
În practică, retrovirusurile, adenovirusurile și virusurile adeno-asociate (AAV) sunt cel mai frecvent utilizate. Pentru început, merită să ne dăm seama care ar trebui să fie candidatul ideal pentru transducția printre viruși. Criteriile sunt că trebuie să fie:

grajd;
. capacitatea, adică de a conține o cantitate suficientă de ADN;
. inertă în raport cu căile metabolice ale celulei;
. precisă - în mod ideal, ar trebui să-și integreze genomul într-un loc specific al genomului nucleului gazdă etc.

În viața reală, este foarte dificil să combinați cel puțin câteva puncte, astfel încât, de obicei, alegerea are loc atunci când luăm în considerare fiecare caz individual separat (Fig. 9).

Fig.9

Dintre cei mai folosiți trei viruși enumerați, AAV este cel mai sigur și, în același timp, cel mai precis. Aproape singurul lor dezavantaj este capacitatea lor relativ mică (aproximativ 4800 bp), care, totuși, se dovedește a fi suficientă pentru multe gene. .

Pe lângă metodele de mai sus, terapia genică este adesea folosită în combinație cu terapia celulară: mai întâi, o cultură de anumite celule umane este plantată într-un mediu nutritiv, apoi genele necesare sunt introduse în celule într-un fel sau altul, cultivate pentru ceva timp și transplantat din nou în organismul gazdă. Ca rezultat, celulele pot reveni la proprietățile lor normale. Deci, de exemplu, globulele albe umane (leucocitele) au fost modificate în leucemie (Fig. 10).

Fig.10

Soarta genei după ce intră în celulă

Deoarece totul este mai mult sau mai puțin clar cu vectorii virali datorită capacității lor de a livra gene mai eficient către ținta finală - nucleul, ne vom opri asupra soartei vectorului plasmidic.

În această etapă, am reușit că ADN-ul a trecut de prima barieră mare - membrana citoplasmatică a celulei.

Mai mult, în combinație cu alte substanțe, învelite sau nu, ea trebuie să realizeze nucleul celular astfel încât o enzimă specială - ARN polimeraza - sintetizează o moleculă de ARN mesager (ARNm) pe un model de ADN (acest proces se numește transcriere). Abia după aceasta, ARNm va intra în citoplasmă, va forma un complex cu ribozomi și, conform cod genetic se sintetizează o polipeptidă - de exemplu, un factor de creștere vasculară (VEGF), care va începe să îndeplinească o anumită funcție terapeutică (în acest caz, va începe procesul de formare a ramificării vasculare în țesutul predispus la ischemie).

În ceea ce privește exprimarea genelor introduse în tipul de celulă dorit, această problemă este rezolvată cu ajutorul elementelor de reglare transcripțională. Țesutul în care are loc expresia este adesea determinat de combinația unui amplificator specific de țesut (secvență de „întărire”) cu un promotor specific (secvența de nucleotide de la care ARN polimeraza începe sinteza), care poate fi inductibil. . Se știe că activitatea genelor poate fi modulată in vivo semnale externe, iar din moment ce amplificatorii pot lucra cu orice genă, izolatorii pot fi introduși și în vectori, care ajută amplificatorul să funcționeze indiferent de poziția sa și se pot comporta ca bariere funcționale între gene. Fiecare amplificator conține un set de situsuri de legare pentru activarea sau suprimarea factorilor proteici. De asemenea, promotorii pot regla nivelul de expresie a genelor. De exemplu, există metalotioneină sau promotori sensibili la temperatură; promotori hormonali.

Exprimarea unei gene depinde de poziția sa în genom. În cele mai multe cazuri, metodele virale existente duc numai la inserarea aleatorie a unei gene în genom. Pentru a elimina o astfel de dependență, atunci când se construiesc vectori, gena este prevăzută cu secvențe de nucleotide cunoscute care permit exprimarea genei indiferent de locul său de inserție în genom.

Cea mai simplă modalitate de a regla expresia transgenei este de a-i oferi un promotor indicator care este sensibil la un semnal fiziologic, cum ar fi eliberarea de glucoză sau hipoxia. Astfel de sisteme de control „endogen” pot fi utile în unele situații, cum ar fi controlul dependent de glucoză al producției de insulină. Mai fiabile și versatile sunt sistemele de control „exogene”, atunci când expresia genelor este controlată farmacologic prin introducerea unei molecule mici de medicament. În prezent, sunt cunoscute 4 sisteme principale de control - reglementate de tetraciclină (Tet), un steroid insectă, ecdizonă sau analogii săi, medicamentul antiprogestin maifpriston (RU486) și dimerizatori chimici precum rapamicina și analogii săi. Toate implică recrutarea dependentă de medicament a domeniului de activare a transcripției către promotorul principal care conduce gena dorită, dar diferă în mecanismele acestei recrutări. .

Concluzie

O revizuire a datelor conduce la concluzia că, în ciuda eforturilor multor laboratoare din lume, toate deja cunoscute și testate in vivoși in vitro sistemele vectoriale sunt departe de a fi perfecte . Dacă problema livrării de ADN străin in vitro practic rezolvată și livrarea acestuia către celulele țintă din diferite țesuturi in vivo rezolvate cu succes (în principal prin crearea de constructe care poartă proteine ​​receptorului, inclusiv antigene specifice anumitor țesuturi), apoi alte caracteristici ale sistemelor vectoriale existente - stabilitatea integrării, expresia reglată, siguranță - mai necesită îmbunătățiri serioase.

În primul rând, se referă la stabilitatea integrării. Până acum, integrarea în genom a fost realizată numai folosind vectori retrovirali sau adeno-asociați. Eficiența integrării stabile poate fi crescută prin îmbunătățirea construcțiilor de gene, cum ar fi sistemele mediate de receptor sau prin crearea de vectori epizomali suficient de stabili (adică structuri ADN capabile de rezidență pe termen lung în interiorul nucleelor). Recent, s-a acordat o atenție deosebită creării de vectori pe baza cromozomilor artificiali de mamifere. Datorită prezenței elementelor structurale de bază ale cromozomilor obișnuiți, astfel de mini-cromozomi sunt reținuți în celule pentru o lungă perioadă de timp și sunt capabili să transporte gene (genomice) de dimensiune completă și elementele lor de reglare naturale, care sunt necesare pentru funcționarea corectă. a genei, în țesutul potrivit și la momentul potrivit.

Terapia genică și celulară deschide perspective strălucitoare pentru restaurarea celulelor și țesuturilor pierdute și proiectarea ingineriei genetice a organelor, care, fără îndoială, va extinde semnificativ arsenalul de metode pentru cercetarea biomedicală și va crea noi oportunități pentru conservarea și prelungirea vieții umane.

30 august 2017 Produse alimentare si Drug Administration (FDA) a aprobat prima terapie genetica din lume pentru cancerul de sange. Acesta este Kymriah (tisagenlecleucel) de la Novartis Pharmaceuticals, care se bazează pe tehnologia CAR-T și este destinat tratamentului leucemiei limfoblastice acute cu celule B la copiii și adulții tineri cu vârsta de până la 25 de ani care sunt refractari la alte tratamente sau care au o recidivă a bolii.

Utilizarea tehnologiei de editare a genomului CRISPR/Cas9 deschide noi posibilități în terapia genică. CRISPR/Cas9 vă permite să schimbați foarte precis și în siguranță ADN-ul celulelor. Și dacă combinăm tehnologia CRISPR/Cas9 cu livrarea folosind viruși adeno-asociați, atunci acest lucru, aparent, va permite un efect sistemic asupra organismului și va schimba complet în siguranță genomul unui număr foarte mare de celule.

Și în 2016, geneticienii de la Universitatea Duke (SUA) au anunțat că, pentru prima dată în istorie, au reușit să efectueze cu succes terapia genetică pe un mamifer adult (șoarece) și să-l vindece de o boală genetică asociată cu distrofia musculară. Pentru aceasta, o versiune modificată a comparativ tehnologie nouă editarea genelor CRISPR/Cas9. Tehnologia de editare a genelor CRISPR/Cas9 implică utilizarea unui virus adeno-asociat pentru a ajuta la livrarea materialului genetic la destinație. Folosind această tehnologie, au fost efectuate experimente de succes pentru a edita genele celulelor individuale în eprubete și embrioni unicelular. Din păcate, până acum, posibilitatea manipulării genetice asupra embrionilor umani este o chestiune de controversă acerbă.

CRISPR/Cas a depășit toate așteptările. A permis, cu un număr minim de erori, atât „dezactivarea” genelor necesare, cât și integrarea de noi gene în regiuni strict definite ale genomului.

În decembrie 2015, echipa de cercetare a lui Feng Jang a modificat acest sistem astfel încât să devină complet fără erori, care a fost publicat în principalul jurnal stiintificŞtiinţă. Oamenii de știință au înlocuit 3 aminoacizi (componentele care compun proteina) în endonucleaza Cas9, după care numărul erorilor dintr-un astfel de sistem a fost redus la aproape zero.

Utilizarea CRISP/Cas9 este relevantă în special pentru terapia genică a îmbătrânirii, unde este necesară influențarea căilor de longevitate comune majorității celulelor corpului. Până în 2015, nu s-au efectuat studii clinice umane privind terapia genică pentru îmbătrânire, ceea ce nu este surprinzător, deoarece îmbătrânirea nu a fost încă recunoscută ca o boală.

În plus, terapia genică pentru îmbătrânire este încă un domeniu foarte tânăr și în curs de dezvoltare. Acum toate studiile privind terapia genică a îmbătrânirii sunt efectuate pe șoareci model, șobolani, maimuțe și culturi de celule umane - celule in vitro.

Toate abordările de terapie genetică a îmbătrânirii sunt împărțite în cele în care gena longevității este livrată organismului și cele în care sunt introduse ARN-uri mici care „opresc” gena sau calea de îmbătrânire. Adică, în primul caz, se introduce ceva util pentru longevitate, iar în al doilea, dăunătorul este oprit. Strict vorbind, au existat doar două studii de terapie genetică privind îmbătrânirea la mamifere până în 2015.

Mult mai multe lucrari terapie genică model la șoarecii transgenici. În astfel de studii, gena terapeutică nu este livrată în corpul unui șoarece adult, dar cu ajutorul ingineriei genetice sunt creați șoareci al căror genom a fost modificat de la naștere. La fel ca terapia genică, aceasta vă permite să explorați modul în care creșterea sau scăderea activității diferitelor gene afectează durata de viață și îmbătrânirea corpului.

Să aruncăm o privire la ce ar putea face teoretic terapia genică și inginerie genetică pentru a combate îmbătrânirea.

Avantajul terapiei genice față de alte metode de extindere a vieții

Prin urmare, dacă vorbim despre traducerea cercetării privind extinderea vieții la oameni, atunci terapia genică are un avantaj absolut, deoarece nu reduce calitatea vieții din cauza necesității tratament permanent- urmați o dietă zilnică sau utilizați în mod constant geroprotectoare sau alte medicamente. De asemenea, terapia genică este foarte țintită și, prin urmare, are potențialul pentru mai puține efecte secundare.

În afară de, medicamente au biodisponibilitate limitată în diferite țesuturi și organe.

Introducerea genei telomerazei (TERT) la șoarecii de tip sălbatic de doi ani (40-50 de ani în termeni umani) cu o singură injecție crește lungimea telomerilor și prelungește viața lor cu 20%.

Omul de știință a sugerat că există un anumit contor de diviziune în celule, limitând numărul lor total. 10 ani mai târziu, omul de știință rus Alexei Olovnikov a propus un mecanism ipotetic pentru funcționarea acestui contor.

Olovnikov a sugerat că în timpul diviziunii celulare, capetele cromozomilor, numite telomeri, se scurtează ușor. Iar când telomerii ating o lungime critică, celula încetează să se divizeze și îmbătrânește. Ulterior, Elizabeth Helen Blackburn, un om de știință citogenetic american, a devenit laureat Premiul Nobel la Fiziologie sau Medicină în 2009, împreună cu Carol Greider și Jack Szostak, cu formularea „pentru descoperirea mecanismelor de protecție a cromozomilor de către telomeri și enzima telomerazei” conform unei teorii propuse în 1971 de Alexei Olovnikov.

Dimpotrivă, în celulele nesenescente (de exemplu, celulele stem germinale și embrionare), trebuie să existe o enzimă care prelungește telomerii, permițând celulelor să se divizeze aproape la nesfârșit. În plus, s-a demonstrat că deteriorarea genei telomerazei scurtează foarte mult viața animalelor model și duce la apariția sindromului de îmbătrânire prematură - progeria.

După descoperirea telomerazei, zeci de oameni de știință au început să încerce să facă un leac pentru bătrânețe pe baza acesteia. S-ar părea că „pornirea” telomerazei în toate celulele poate face corpul nemuritor. Cu toate acestea, temerile au apărut în curând din cauza faptului că sinteza activă a telomerazei este observată în 90% tumori canceroase. A apărut întrebarea: activarea telomerazei ar duce la riscul transformării maligne?

În plus, s-a dovedit că îmbătrânirea celulară nu este întotdeauna însoțită de o reducere a telomerilor. De exemplu, în cazul celulelor epiteliale ale mucoasei bucale sau corneei ochiului uman. Acest lucru a sugerat că activarea telomerazei singură ar putea să nu fie suficientă pentru a întineri întregul corp. Înainte de a trece la terapia genică, efectele telomerazei au fost studiate la șoarecii transgenici. S-a dovedit că dacă „activați” gena TERT în toate celulele de șoarece, atunci speranța de viață crește cu 40%! Cu toate acestea, activitatea constantă a telomerazei a crescut și riscul de cancer. Prin urmare, a apărut întrebarea cum să activați activitatea telomerazei pentru o perioadă mai scurtă.

Astăzi, telomeraza poate fi stimulată și cu medicamente. Un studiu interesant în acest domeniu a fost realizat de oamenii de știință de la Universitatea din Ljubljana (Slovenia) în 2016, după o serie de studii clinice de succes privind întinerirea vasculară cu doze mici de valsartan și fluvastatină. De data aceasta, au măsurat activitatea telomerazei după întinerirea vasculară în probe de sânge de la 130 de pacienți.

Astfel, un curs de o lună crește semnificativ activitatea telomerazei de 3,28 ori, ceea ce se corelează semnificativ cu o îmbunătățire a funcției endoteliale (întinerire vasculară) și o scădere a inflamației vaselor de sânge. Si acesta nivel ridicat telomeraza persistă, scăzând treptat, încă șase luni. Dar cât de eficient o astfel de creștere a telomerazei afectează telomerii rămâne de stabilit.

Este important de știut că telomerii nu ne pot prelungi neapărat viața dacă o astfel de terapie nu se face la momentul potrivit și pentru prea mult timp.

În plus, stimularea telomerazei singură nu poate prelungi telomerii. Activitatea telomerazei aproape că nu se schimbă odată cu vârsta - uitați-vă la graficul din stânga. Și telomerii încă se micșorează.

De asemenea, astăzi există pe piață un medicament care crește activitatea telomerazei - TA-65. Este foarte scump, iar viața șoarecilor nu s-a extins în niciun fel în studii. Vezi aici graficul din stânga. Într-un studiu din 2011, oamenii de știință de la Naționalul Spaniol Centrul de cancer a început să dea șoarecilor cu viață lungă de doi ani TA-65 pentru a crește telomeraza, ca în studiul anterior. Doar într-un studiu anterior, șoarecii au fost injectați pentru terapie genică. Dar medicamentul TA-65 nu a prelungit în niciun fel viața șoarecilor, spre deosebire de terapia genică (vezi graficul din stânga) și a fost complet inutil pentru prelungirea vieții și încetinirea îmbătrânirii.

În 2011, oamenii de știință de la Universitatea din Texas au studiat telomerii și telomeraza în culturi de celule a peste 60 de specii de mamifere. Rolul telomerilor în longevitate s-a dovedit a nu fi atât de evident... Studiile arată (când se compară aproximativ 60 de specii de mamifere), cu cât telomerii mai lungi dintr-o specie, cu atât mai repede se acumulează mutații ADN în ea, mai multe tumori canceroase și o speranță de viață mai scurtă. . Lungimea telomerelor este invers corelată cu durata de viață. Acest lucru sugerează că rezultatul prelungirii vieții telomerazei, care a fost obținut la șoareci cu o singură injecție, poate să nu prelungească viața oamenilor. Problema telomerilor pentru oameni rămâne deschisă.

Concluzie:În viitor, teoretic, vom putea crește lungimea telomerilor cu ajutorul introducerii genei telomerazei (TERT) la vârsta de 40-50 de ani cu o singură injecție, dar o astfel de terapie în sine nu este în mod clar suficientă. . Cel mai repede, trebuie să găsim o combinație de efecte ale terapiei genice pentru a extinde semnificativ viața umană. Astăzi, putem imita efectul cu o combinație de medicamente de o lună, șase luni. valsartan 20 mg + fluvastatina 10-20 mg, sau telmisartan + atorvastatina 10 mg. Cel puțin aceste medicamente în combinație sunt capabile să stimuleze telomeraza în sine.

Perturbarea genei Agtr1a care codifică receptorii angiotensinei AT1a prelungește viața șoarecilor transgenici cu 26% în comparație cu șoarecii de tip sălbatic.

Kaplan, folosind exemplul primatelor, a arătat că dacă colectați un grup de primate masculi, atunci în câteva zile maimuțele vor avea o ierarhie socială. Cel mai rău loc într-o astfel de ierarhie este cel de jos. Primatele masculi aflate într-o poziție subordonată prezintă o serie de indicatori ai stresului cronic. Ei dezvoltă adesea ateroscleroză. Când oamenii de știință le-au dat primatelor masculi din partea de jos a ierarhiei sociale (la risc) un beta-blocant propranolol suprimarea activității sistemului nervos simpatic, apoi ateroscleroza vasculară nu s-a dezvoltat.

S-a dovedit că sistemul nervos simpatic, din cauza stresului, afectează negativ dezvoltarea aterosclerozei și este implicat în probleme cu inima și vasele de sânge. Stresul emoțional se manifestă prin sistemul nervos autonom simpatic (adrenergic), care conectează centrele de control ale creierului nostru și organe interne. Inclusiv - cu imunitate, măduvă osoasă si altele.Ateroscleroza este principalul factor care duce la cel mai mare numar de decese in tarile dezvoltate prin infarct de inima si accident vascular cerebral cerebral.

Un studiu randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo din 1983, organizat de Goldstein S și colegii săi, a arătat că terapia propranolol la 3837 de pacienti cu infarct miocardic acut, reduce mortalitatea prin boli cardiovasculare (cauza numarul 1 de deces in lume).

În martie 2017, oamenii de știință francezi au raportat studii clinice de succes de terapie genică pentru tratamentul anemiei falciforme.

Un comitet al Academiei Naționale de Științe Americane și al Academiei Naționale de Medicină a oferit sprijin pentru editarea genomului embrionilor umani încă din 2017. Dar numai pentru boală gravăși sub control strict.

constatări

1. Toate abordările de terapie genetică a îmbătrânirii sunt împărțite în cele în care gena longevității este livrată organismului și cele în care gena sau calea de îmbătrânire este „dezactivată”.

2. În comparație cu alte abordări de extindere a vieții, terapia genică trebuie făcută doar o dată în viață.

3. Inserarea genei telomerazei (TERT), perturbarea genei Agtr1a, knockout GHRKO, perturbare a genelor care codifică receptorii IGF-1, supraexpresie FGF21, knockout AC5, deleție RIP3, editarea genei PCSK9, supraexpresie Klotho, supraexpresie RAGE BubR1, expresie, supraexpresia MTH1 sunt toate exemple dintre cele mai multe moduri eficiente inginerie genetică sau terapie genetică pentru a prelungi viața animalelor.

4. Pentru a obține rezultate mai semnificative în terapia genică a îmbătrânirii și în inginerie genetică împotriva îmbătrânirii, este necesară combinarea diferitelor abordări. Adaugă etichete

Terapia genică este tratamentul ereditar, neereditare, care se realizează prin introducerea altor gene în celulele pacientului. Scopul terapiei este de a elimina defectele genelor sau de a oferi celulelor noi funcții. Este mult mai ușor să introduceți o genă sănătoasă, pe deplin funcțională într-o celulă decât să corectați defectele uneia existente.

Terapia genică se limitează la studii în țesuturi somatice. Acest lucru se datorează faptului că orice intervenție în celulele sexuale și germinale poate da un rezultat complet imprevizibil.

Tehnica utilizată în prezent este eficientă în tratamentul bolilor atât monogenice, cât și multifactoriale (tumori maligne, unele tipuri de boli cardiovasculare severe, virale).

Aproximativ 80% din toate proiectele de terapie genetică se referă la infecția cu HIV și sunt în prezent cercetate, cum ar fi hemofilia B, fibroza chistică, hipercolesterolemia.

Tratamentul include:

izolarea și propagarea tipurilor individuale de celule de pacient;

introducerea de gene străine;

selectarea celulelor în care gena străină a „prins rădăcini”;

Implantarea acestora la pacient (de exemplu, prin transfuzie de sânge).

Terapia genică se bazează pe introducerea ADN-ului clonat în țesuturile pacientului. cu cel mai mult metode eficiente aceasta include vaccinurile injectabile și cu aerosoli.

Terapia genică funcționează în două moduri:

1. Tratamentul bolilor monogenice. Acestea includ tulburări ale creierului, care sunt asociate cu orice deteriorare a celulelor care produc neurotransmițători.

2. Tratament Principalele abordări utilizate în acest domeniu sunt:

îmbunătățire genetică celule ale sistemului imunitar;

creșterea imunoreactivității tumorii;

bloc de expresie a oncogenei;

protecția celulelor sănătoase de la chimioterapie;

introducerea genelor supresoare tumorale;

producerea de substanțe anticanceroase de către celulele sănătoase;

producerea de vaccinuri antitumorale;

reproducerea locală a țesuturilor normale cu ajutorul antioxidanților.

Utilizarea terapiei genice are multe avantaje și în unele cazuri este singura șansă pentru viata normala pentru persoanele bolnave. Cu toate acestea, acest domeniu al științei nu a fost pe deplin explorat. Există o interdicție internațională privind testarea sexului și a celulelor germinale preimplantare. Acest lucru se face pentru a preveni construcțiile și mutațiile genice nedorite.

Unele condiții în care sunt permise studiile clinice au fost dezvoltate și sunt în general recunoscute:

Gena transferată la celulele țintă trebuie să fie activă o perioadă lungă de timp.

Într-un mediu străin, gena trebuie să-și păstreze eficiența.

Transferul genelor nu ar trebui să provoace reacții negative în organism.

Există o serie de întrebări care rămân relevante astăzi pentru mulți oameni de știință din întreaga lume:

Oamenii de știință care lucrează în domeniul terapiei genice vor fi capabili să dezvolte o corecție completă a genelor care să nu reprezinte o amenințare pentru descendenți?

Nevoia și beneficiile unei proceduri de terapie genetică pentru un cuplu individual vor depăși riscul acestei intervenții pentru viitorul umanității?

Sunt proceduri similare justificate, având în vedere viitorul?

Cum se vor corela astfel de proceduri asupra oamenilor cu întrebările de homeostazie ale biosferei și ale societății?

În concluzie, se poate observa că terapia genetică în stadiul actual oferă omenirii modalități de a trata cel mai mult boală gravă, care până de curând erau considerate incurabile și fatale. Totuși, în același timp, dezvoltarea acestei științe pune noi probleme oamenilor de știință care trebuie abordate astăzi.