Μέθοδοι γενετικής επιμόλυνσης στη γονιδιακή θεραπεία. Βασικές αρχές της Μοριακής Θεραπείας

Υγεία

Η ιδέα της αντικατάστασης ελαττωματικών γονιδίων με υγιή, που άρχισε να αποκτά ενεργά επιστημονικό κέλυφος στις αρχές της δεκαετίας του ενενήντα του περασμένου αιώναφαινόταν να δίνει ελπίδα στους πιο απελπισμένους ασθενείς. Ωστόσο, από το πρώτο πείραμα για τη γονιδιακή θεραπεία, που πραγματοποιήθηκε το 1990, η αισιοδοξία μεταξύ των επιστημόνων έχει κάπως μειωθεί - και όλα αυτά λόγω ορισμένων αποτυχιών και δυσκολιών στην εφαρμογή των μεθόδων γονιδιακής θεραπείας. Ωστόσο, οι δυνατότητες που προσφέρει η γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία της νόσου του Πάρκινσον, της κυστικής ίνωσης, διάφορα είδηο καρκίνος και πολλές άλλες ασθένειες είναι πραγματικά απεριόριστες. Γι' αυτό οι επιστήμονες εργάζονται ακούρασταπροσπαθώντας να ξεπεράσουν όλες τις δυσκολίες που προκύπτουν στον τρόπο τους που σχετίζονται με τη γονιδιακή θεραπεία.

Τι είναι η γονιδιακή θεραπεία;

Τι ακριβώς είναι λοιπόν η γονιδιακή θεραπεία; Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, είναι απαραίτητο να υπενθυμίσουμε ότι η κύρια λειτουργία των γονιδίων στο σώμα μας είναι να ρυθμίζουν την παραγωγή πρωτεϊνώναπαραίτητο για τη φυσιολογική λειτουργία και υγεία όλων των κυττάρων. Όμως ορισμένα γενετικά ελαττώματα (ελαττώματα στα γονίδια) παρεμβαίνουν στην κύρια λειτουργία τους, σε έναν ή τον άλλο βαθμό, εμποδίζοντας την παραγωγή πρωτεϊνών. Ο στόχος της γονιδιακής θεραπείας (γονιδιακή θεραπεία) είναι αντικατάσταση ελαττωματικών γονιδίων με υγιή. Αυτό θα βοηθήσει στην καθιέρωση της αναπαραγωγής της αντίστοιχης πρωτεΐνης, πράγμα που σημαίνει ότι ένα άτομο θα θεραπευτεί από μια συγκεκριμένη ασθένεια.

Λαμβάνοντας υπόψη το ιδανικό σενάριο ανάπτυξης, τα κύτταρα με προσαρμοσμένα μόρια δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA)θα αρχίσει να διαιρείται, παράγοντας, με τη σειρά του, πολλαπλά αντίγραφα του διορθωμένου γονιδίου, το οποίο θα επιτρέψει στον οργανισμό να απαλλαγεί από τη γενετική ανωμαλία και να θεραπεύσει πλήρως. Ωστόσο, η εισαγωγή υγιών γονιδίων σε νοσούντα κύτταρα (καθώς και οι προσπάθειες διόρθωσης των αντίστοιχων αποκλίσεων) είναι μια εξαιρετικά περίπλοκη διαδικασία, που μέχρι στιγμής σπάνια έχει πετύχει.. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο οι περισσότερες σύγχρονες έρευνες στοχεύουν στην ανάπτυξη ασφαλών και αξιόπιστων μηχανισμών για την εισαγωγή γονιδίων σε κατεστραμμένα κύτταρα.

Τύποι γονιδιακής θεραπείας: ex vivo και in vivo θεραπεία

Μπορεί να πραγματοποιηθεί γονιδιακή θεραπεία, ανάλογα με τη μέθοδο εισαγωγής DNA στο γονιδίωμα του ασθενούς είτε σε κυτταρική καλλιέργεια (ex vivo) είτε απευθείας στο σώμα (in vivo). Στην περίπτωση της ex vivo γονιδιακής θεραπείας, τα κύτταρα αφαιρούνται από το σώμα του ασθενούς, τροποποιούνται γενετικά και στη συνέχεια επανεισάγονται στο σώμα του ατόμου. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στη θεραπεία διαταραχών του αίματος, καθώς τα κύτταρα του αίματος μπορούν να αφαιρεθούν και να επανατοποθετηθούν αρκετά εύκολα. Ωστόσο, στην περίπτωση των περισσότερων άλλων ασθενειών, η αφαίρεση κυττάρων από το σώμα και η επαναφορά τους δεν είναι καθόλου εύκολη. Για παράδειγμα, στην περίπτωση καρδιακών παθήσεων που οφείλονται σε γενετικά αίτια, ένα αποτελεσματικό μέτρο είναι η λεγόμενη in vivo γονιδιακή θεραπεία, όταν οι γονιδιακές αλλαγές πραγματοποιούνται απευθείας στο σώμα του ασθενούς. Για να γίνει αυτή η διαδικασία, η γενετική πληροφορία παρέχεται απευθείας στο κύτταρο μέσω ενός φορέα - ενός μορίου νουκλεϊκού οξέος, χρησιμοποιείται στη γενετική μηχανική για τη μεταφορά γενετικού υλικού. Στις περισσότερες περιπτώσεις, για να πραγματοποιηθεί αυτή η μετάδοση, οι ερευνητές χρησιμοποιούν ιούς που δεν είναι επικίνδυνοι για την υγεία και τη ζωή.

Μέθοδοι μεταφοράς γενετικών πληροφοριών στο κύτταρο

Πολυάριθμες μελέτες δείχνουν ότι η χρήση διαφόρων ιών είναι μια πολύ αποτελεσματική λύση, που σας επιτρέπει να περάσετε τις ανοσοποιητικές άμυνες του οργανισμούκαι στη συνέχεια μολύνουν τα κύτταρα, χρησιμοποιώντας τα για τη διάδοση του ιού. Για τη διεξαγωγή αυτής της διαδικασίας, οι γενετικοί μηχανικοί επέλεξαν τους καταλληλότερους ιούς από την ομάδα των ρετροϊών και των αδενοϊών. Οι ρετροϊοί φέρνουν γενετικές πληροφορίες με τη μορφή ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA), ενός μορίου που μοιάζει με DNA που βοηθά στην επεξεργασία της γενετικής πληροφορίας που είναι αποθηκευμένη στο DNA. Μόλις καταστεί δυνατή η βαθιά διείσδυση στο λεγόμενο κύτταρο στόχο, ένα αντίγραφο του μορίου DNA λαμβάνεται από το μόριο RNA. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή.Μόλις ένα νέο μόριο DNA συνδεθεί σε ένα κύτταρο, όλα τα νέα αντίγραφα του κυττάρου θα περιέχουν αυτό το τροποποιημένο γονίδιο.

Οι αδενοϊοί μεταφέρουν γενετικές πληροφορίες αμέσως με τη μορφή DNA, το οποίο παραδίδεται σε ένα μη διαιρούμενο κύτταρο. Παρόλο Αυτοί οι ιοί παρέχουν DNA απευθείας στον πυρήνα του κυττάρου στόχουΤο DNA δεν ταιριάζει στο γονιδίωμα του κυττάρου. Έτσι, το τροποποιημένο γονίδιο και οι γενετικές πληροφορίες δεν μεταβιβάζονται στα θυγατρικά κύτταρα. Το πλεονέκτημα της γονιδιακής θεραπείας που πραγματοποιείται με χρήση αδενοϊών είναι ότι είναι δυνατή η εισαγωγή γονιδίων στα κύτταρα του νευρικού συστήματος και στη βλεννογόνο μεμβράνη αναπνευστικής οδού, πάλι, μέσω ενός διανύσματος. Επιπλέον, υπάρχει μια τρίτη μέθοδος γονιδιακής θεραπείας, που πραγματοποιείται μέσω των λεγόμενων αδενο-σχετιζόμενων ιών. Αυτοί οι ιοί περιέχουν σχετικά μικρή ποσότητα γενετικών πληροφοριώνκαι είναι πολύ πιο δύσκολο να εξαλειφθούν από τους ρετροϊούς και τους αδενοϊούς. Ωστόσο, το πλεονέκτημα των αδενο-σχετιζόμενων ιών είναι ότι δεν προκαλούν αντίδραση ανοσοποιητικό σύστημαπρόσωπο.

Δυσκολίες κατά τη χρήση ιών στη γονιδιακή θεραπεία

Το κύριο πρόβλημα που σχετίζεται με τη μέθοδο παροχής γενετικής πληροφορίας στο κύτταρο μέσω ιών είναι ότι είναι εξαιρετικά δύσκολο να ελεγχθεί πλήρως η σύνδεση των γονιδίων με ένα κύτταρο στόχο. Αυτό μπορεί να είναι εξαιρετικά επικίνδυνο, αφού δεν αποκλείεται η λεγόμενη γονιδιακή έκφραση, που μπορεί να μετατρέψει τα υγιή κύτταρα σε καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη χρονική στιγμή, αυτό το πρόβλημα είναι ιδιαίτερα σημαντικό στην αντιμετώπιση των ρετροϊών. Το δεύτερο πρόβλημα η λύση του οποίου δεν είναι ακόμη δυνατό να οργανωθεί, έγκειται στο γεγονός ότι μια διαδικασία για τη χρήση γονιδιακής θεραπείας, τις περισσότερες φορές, δεν αρκεί. Οι περισσότερες γενετικές θεραπείες πρέπει να επαναλαμβάνονται από καιρό σε καιρό. Και, τρίτον, η χρήση ιών για τη μεταφορά γενετικών πληροφοριών σε ένα κύτταρο περιπλέκεται από τον κίνδυνο αντίδρασης του ανοσοποιητικού συστήματος του σώματος. Αυτό είναι επίσης ένα εξαιρετικά σοβαρό πρόβλημα, ειδικά σε περιπτώσεις όπου όταν απαιτείται επαναλαμβανόμενη επανάληψη της διαδικασίας γονιδιακής θεραπείας, καθώς ο οργανισμός του ασθενούς σταδιακά προσαρμόζεται και αρχίζει να καταπολεμά τους ενέσιμους ιούς όλο και πιο αποτελεσματικά.

Γονιδιακή θεραπεία: Η έρευνα συνεχίζεται

Αν μιλάμε για επιτυχία, τότε σε αυτή τη χρονική στιγμή, η γενετική θεραπεία είναι ένα εξαιρετικά αποτελεσματικό μέτρο. στη θεραπεία της λεγόμενης συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας, που συνδέεται με το γονίδιο του χρωμοσώματος Χ. Από την άλλη, ελάχιστες είναι οι περιπτώσεις επιτυχούς χρήσης γονιδιακής θεραπείας για τη θεραπεία αυτής της νόσου. Επιπλέον, η ίδια η θεραπεία είναι ένα επικίνδυνο εγχείρημα, καθώς μπορεί να προκαλέσει μια σειρά από συμπτώματα σε ασθενείς που εντοπίζονται σε άτομα που πάσχουν από λευχαιμία. Εκτός από αυτή την ασθένεια, υπάρχουν πολύ, πολύ λίγες περιπτώσεις χρήσης γονιδιακής θεραπείας που θα ήταν εξίσου αποτελεσματικές, αν και πρόσφατες μελέτες δίνουν ελπίδες για την πρώιμη χρήση της γονιδιακής θεραπείαςγια τη θεραπεία ασθενών που πάσχουν από αρθρίτιδα, καρκίνο του εγκεφάλου, δρεπανοκυτταρική αναιμία, σχισμή αμφιβληστροειδούς και κάποιες άλλες παθήσεις.

Αποδεικνύεται ότι είναι πολύ νωρίς για να μιλήσουμε για την πρακτική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας στην ιατρική. Παρόλα αυτά, Οι ερευνητές συνεχίζουν να αναζητούν τρόπους για τη χρήση της γονιδιακής θεραπείας με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα, έχοντας πραγματοποιήσει τα περισσότερα από τα πειράματα σε ζωντανό ιστό που μεταφέρεται από το σώμα σε ένα τεχνητό εξωτερικό περιβάλλον. Μεταξύ αυτών των πειραμάτων, οι μελέτες στις οποίες οι επιστήμονες προσπαθούν να εισαγάγουν ένα τεχνητό, 47ο χρωμόσωμα σε ένα κύτταρο στόχο, είναι εξαιρετικά ενδιαφέρουσες. Πρόσφατα επιστημονικά ευρήματα έδωσαν τη δυνατότητα στους επιστήμονες να κατανοήσουν καλύτερα τις διαδικασίες που συμβαίνει κατά την εισαγωγή ενός μορίου RNA. Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη ενός μηχανισμού για την καταστολή της γονιδιακής μεταγραφής (το λεγόμενο γονιδιακό knockout), ο οποίος μπορεί να είναι επωφελής στη θεραπεία της νόσου του Hamilton. Οι επιστήμονες αναφέρουν επίσης ότι κατάφεραν να αναπτύξουν έναν τρόπο παράδοσης γενετικής πληροφορίας στα εγκεφαλικά κύτταρα, κάτι που προηγουμένως δεν μπορούσε να γίνει χρησιμοποιώντας φορέα. αφού αυτό το μόριο ήταν πολύ μεγάλο για αυτόν τον σκοπό. Με άλλα λόγια, η έρευνα συνεχίζεται, πράγμα που σημαίνει ότι η ανθρωπότητα έχει κάθε ευκαιρία να μάθει πώς να καταπολεμά τις ασθένειες μέσω της χρήσης μεθόδων γονιδιακής θεραπείας.

14943 0

Καθορισμός της θέσης και της αλληλουχίας ενός γονιδίου του οποίου οι μεταλλάξεις προκαλούν συγκεκριμένες ασθένειες, καθώς και την ίδια τη μετάλλαξη και σύγχρονους τρόπουςΗ δοκιμή του καθιστά δυνατή τη διάγνωση της νόσου στη νεο- και ακόμη και στην προγεννητική περίοδο ανάπτυξης του οργανισμού. Αυτό καθιστά δυνατό τον μετριασμό της εκδήλωσης ενός γενετικού ελαττώματος με τη βοήθεια φαρμακευτικής θεραπείας, δίαιτας, μετάγγισης αίματος κ.λπ.

Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση δεν οδηγεί στη διόρθωση του ίδιου του ελαττώματος και, κατά κανόνα, οι κληρονομικές ασθένειες δεν μπορούν να θεραπευτούν. Η κατάσταση περιπλέκεται περαιτέρω από το γεγονός ότι η μετάλλαξη ενός γονιδίου μπορεί να έχει ποικίλες συνέπειες στον οργανισμό. Εάν μια γονιδιακή μετάλλαξη προκαλεί αλλαγές στη δραστηριότητα του ενζύμου που κωδικοποιεί, τότε αυτό μπορεί να οδηγήσει στη συσσώρευση ενός τοξικού υποστρώματος ή, αντίθετα, σε ανεπάρκεια μιας ένωσης απαραίτητης για την κανονική λειτουργία του κυττάρου.

Ένα πολύ γνωστό παράδειγμα μιας τέτοιας ασθένειας είναι η φαινυλκετονουρία. Προκαλείται από μια μετάλλαξη στο γονίδιο του ηπατικού ενζύμου αφυδροξυλάση φαινυλαλανίνης, το οποίο καταλύει τη μετατροπή της φαινυλαλανίνης σε τυροσίνη. Ως αποτέλεσμα, το επίπεδο της ενδογενούς φαινυλαλανίνης στο αίμα αυξάνεται, γεγονός που προκαλεί ακατάλληλο σχηματισμό της θήκης μυελίνης γύρω από τους άξονες. νευρικά κύτταρακεντρικό νευρικό σύστημα και, κατά συνέπεια, σοβαρή νοητική υστέρηση.

Εάν η μετάλλαξη επηρεάζει το γονίδιο της δομικής πρωτεΐνης, τότε αυτό μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές διαταραχές σε επίπεδο κυττάρων, ιστών ή οργάνων. Ένα παράδειγμα μιας τέτοιας ασθένειας είναι η κυστική ίνωση.

Μια διαγραφή στο γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που ονομάζεται μεταφορέας της κυστικής ίνωσης οδηγεί στη σύνθεση μιας ελαττωματικής πρωτεΐνης (απουσία φαινυλαλανίνης 508) και σε εξασθενημένη μεταφορά ιόντων χλωρίου μέσω των κυτταρικών μεμβρανών. Μία από τις πιο βλαβερές συνέπειες αυτού είναι ότι η βλέννα που καλύπτει και προστατεύει τους πνεύμονες γίνεται ασυνήθιστα παχύρρευστη. Αυτό καθιστά δύσκολη την πρόσβαση στα κύτταρα των πνευμόνων και συμβάλλει στη συσσώρευση επιβλαβών μικροοργανισμών. Τα κύτταρα που επενδύουν τους αεραγωγούς των πνευμόνων πεθαίνουν και αντικαθίστανται από ινώδη ουλώδη ιστό (εξ ου και το όνομα της νόσου). Ως αποτέλεσμα, ο ασθενής πεθαίνει από αναπνευστική ανεπάρκεια.

Οι κληρονομικές ασθένειες είναι πολύπλοκες κλινικές ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ, και η παραδοσιακή τους θεραπεία είναι κυρίως συμπτωματική: για τη θεραπεία της φαινυλκετονουρίας συνταγογραφείται δίαιτα χωρίς αλανίνη, οι ελαττωματικές πρωτεΐνες αντικαθίστανται με λειτουργικές. ενδοφλέβια χορήγηση, για την αντιστάθμιση των χαμένων λειτουργιών, γίνεται μεταμόσχευση μυελού των οστών ή άλλων οργάνων. Όλα αυτά τα μέτρα, κατά κανόνα, είναι αναποτελεσματικά, ακριβά, μακροπρόθεσμα και μόνο λίγοι ασθενείς ζουν μέχρι τα βαθιά γεράματα. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη θεμελιωδώς νέων τύπων θεραπείας είναι πολύ σημαντική.

Γονιδιακή θεραπεία

Το 1990, στις ΗΠΑ, ο Δρ. W. French Andrson έκανε την πρώτη προσπάθεια γονιδιακής θεραπείας για τη θεραπεία της σοβαρής συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας (SCID) σε ένα τρίχρονο κορίτσι, την Ashanti de Silva. Αυτή η ασθένεια προκαλείται από μια μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί την αδενοσαναδενυλάση (ADA). Η ανεπάρκεια αυτού του ενζύμου συμβάλλει στη συσσώρευση αδενοσίνης και δεοξυαδενοσίνης στο αίμα, τοξική επίδρασηπου οδηγεί στο θάνατο των Β- και Τ-λεμφοκυττάρων περιφερικό αίμακαι κατά συνέπεια ανοσοανεπάρκεια.

Τα παιδιά με μια τέτοια ασθένεια πρέπει να προστατεύονται από οποιεσδήποτε λοιμώξεις (φυλάσσονται σε ειδικά αποστειρωμένα κελιά), καθώς οποιαδήποτε ασθένεια μπορεί να είναι θανατηφόρα. Τέσσερα χρόνια μετά την έναρξη της θεραπείας, το παιδί έδειξε μια φυσιολογικά λειτουργούσα ADA και ανακούφιση από τα συμπτώματα SCID, γεγονός που της επέτρεψε να φύγει από τον αποστειρωμένο θάλαμο και να ζήσει μια φυσιολογική ζωή.

Έτσι, αποδείχθηκε η θεμελιώδης δυνατότητα επιτυχούς γενετικής θεραπείας σωματικών κυττάρων. Από τη δεκαετία του '90. υποβάλλονται σε δοκιμές γονιδιακής θεραπείας για μια σειρά γενετικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων σοβαρών όπως η αιμορροφιλία, το AIDS, ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ κακοήθη νεοπλάσματα, κυστική ίνωση, κ.λπ. Αυτή τη στιγμή, περίπου 10 ανθρώπινες ασθένειες μπορούν να θεραπευτούν με τη βοήθεια της διαγενέσεως.

Η ποικιλία των γενετικών ασθενειών έχει προκαθορίσει την ανάπτυξη πολλών προσεγγίσεων στη γονιδιακή θεραπεία. Σε αυτή την περίπτωση, επιλύονται 2 κύρια προβλήματα: ένα μέσο παροχής ενός θεραπευτικού γονιδίου. μια μέθοδος για την παροχή στοχευμένης παροχής σε κύτταρα που προορίζονται για διόρθωση. Μέχρι σήμερα, όλες οι προσεγγίσεις στη γονιδιακή θεραπεία σωματικών κυττάρων μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: ex vivo και in vivo θεραπεία (Εικ. 3.15).

Ρύζι. 3.15. Σχέδιο γονιδιακής θεραπείας ex vivo (α) και in vivo (α)

Η in vivo γονιδιακή θεραπεία περιλαμβάνει την παροχή ενός θεραπευτικού γονιδίου απευθείας στα κύτταρα ενός συγκεκριμένου ιστού ασθενούς. Ας εξετάσουμε αυτές τις προσεγγίσεις με περισσότερες λεπτομέρειες.

Η γονιδιακή θεραπεία ex vivo περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:
1) λήψη ελαττωματικών κυττάρων του ασθενούς και καλλιέργειά τους.
2) μεταφορά του επιθυμητού γονιδίου σε απομονωμένα κύτταρα με διαμόλυνση ενός κατασκευάσματος θεραπευτικού γονιδίου.
3) επιλογή και ανάπτυξη γενετικά διορθωμένων κυττάρων.
4) μεταμόσχευση ή μετάγγιση αυτών των κυττάρων στον ασθενή.

Η χρήση των κυττάρων του ίδιου του ασθενούς διασφαλίζει ότι από τη στιγμή που θα επιστραφούν, ο ασθενής δεν θα αναπτύξει ανοσοαπόκριση. Η διαδικασία μεταφοράς του κατασκευάσματος γονιδίου πρέπει να είναι αποτελεσματική και το φυσιολογικό γονίδιο πρέπει να διατηρείται σταθερά και να εκφράζεται συνεχώς.

Τα μέσα μεταφοράς γονιδίων που δημιουργούνται από την ίδια τη φύση είναι οι ιοί. Προκειμένου να ληφθούν αποτελεσματικοί φορείς για τη μεταφορά γονιδίων, χρησιμοποιούνται κυρίως δύο ομάδες ιών - αδενοϊοί και ρετροϊοί (Εικ. 3.16). Στη γονιδιακή θεραπεία, χρησιμοποιούνται παραλλαγές γενετικά εξουδετερωμένων ιών.

Ρύζι. 3.16. Ιοί που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία θεραπευτικών φορέων

Ρύζι. 3.17. Γενετικός χάρτης ενός τυπικού ρετροϊού (α) και χάρτης φορέα ρετροϊού (α)

Με τη λήψη ενός ρετροϊικού φορέα, το πλήρους μήκους DNA του ρετροϊού εισάγεται στο πλασμίδιο, το μεγαλύτερο μέρος του γονιδίου gag αφαιρείται και τα γονίδια pol και env αφαιρούνται πλήρως και αντί για αυτά, το «θεραπευτικό» γονίδιο Τ και , εάν είναι απαραίτητο, εισάγεται το επιλεκτικό γονίδιο δείκτη Rg με τον δικό του προαγωγέα (Εικ. 3.17, β). Η μεταγραφή του γονιδίου Τ θα ελέγχεται από τον ίδιο ισχυρό προαγωγέα που εντοπίζεται στην περιοχή 5'-LTR. Με βάση αυτό το σχήμα, δημιουργήθηκαν διάφοροι ρετροϊικοί φορείς και το μέγιστο μέγεθος ένθετου DNA περίπου 8 kb.

Το κατασκεύασμα που λαμβάνεται με αυτόν τον τρόπο μπορεί να χρησιμοποιηθεί από μόνο του για μετασχηματισμό, αλλά η αποτελεσματικότητά του και η επακόλουθη ενσωμάτωσή του στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή είναι εξαιρετικά χαμηλή. Ως εκ τούτου, αναπτύχθηκε μια τεχνική για τη συσκευασία πλήρους μήκους RNA φορέα ρετροϊού σε άθικτα ιικά σωματίδια, τα οποία υψηλή συχνότηταδιεισδύουν στο κύτταρο και είναι εγγυημένα ότι ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του ξενιστή. Για αυτό, δημιουργήθηκε μια λεγόμενη κυτταρική γραμμή «συσκευασίας». Σε δύο διαφορετικά μέρη των χρωμοσωμάτων αυτών των κυττάρων, ράβονται τα ρετροϊικά γονίδια gag και pol-env, τα οποία στερούνται της ικανότητας συσσώρευσης λόγω της έλλειψης της αλληλουχίας + (84*+) (Εικ. 3.18).

Ρύζι. 3.18. Σχέδιο για τη λήψη ενός συσκευασμένου ιικού φορέα

Οι ρετροϊοί μολύνουν ενεργά μόνο τα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Για τη μεταφορά γονιδίων, υποβάλλονται σε επεξεργασία με καθαρισμένα συσκευασμένα σωματίδια ρετροϊικού φορέα ή συγκαλλιεργούνται με μια κυτταρική σειρά που τα παράγει και στη συνέχεια επιλέγονται για να διαχωριστούν τα κύτταρα-στόχοι και τα κύτταρα συσκευασίας.

Τα μεταδιεγερθέντα κύτταρα ελέγχονται προσεκτικά για το επίπεδο σύνθεσης του θεραπευτικού γονιδιακού προϊόντος, την απουσία ρετροϊών ικανών για αναπαραγωγή, την απουσία αλλαγών στην ικανότητα των κυττάρων να αναπτύσσονται ή να λειτουργούν.

Τα καταλληλότερα για γονιδιακή θεραπεία είναι τα κύτταρα του μυελού των οστών. Αυτό οφείλεται στην παρουσία παντοδύναμων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε αυτό, τα οποία μπορούν να πολλαπλασιαστούν και να διαφοροποιηθούν σε ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙκύτταρα -Β- και Τ-λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, ερυθροκύτταρα, αιμοπετάλια και οστεοκλάστες. Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία μιας σειράς κληρονομικών ασθενειών, μεταξύ των οποίων η ήδη αναφερθείσα σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια, η νόσος Gaucher, η δρεπανοκυτταρική αναιμία, η θαλασσαιμία, η οστεοπόρωση κ.λπ.

Εκτός από τα παντοδύναμα βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών, τα οποία είναι δύσκολο να απομονωθούν και να καλλιεργηθούν, χρησιμοποιούνται βλαστοκύτταρα αίματος ομφάλιου λώρου (η προτιμώμενη χρήση για τη γονιδιακή θεραπεία νεογνών), καθώς και ηπατικά κύτταρα - ηπατοκύτταρα - για τη θεραπεία της υπερχοληστερολαιμίας.

Στην in vivo γονιδιακή θεραπεία, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να εξασφαλιστεί η παροχή του θεραπευτικού γονιδίου σε ελαττωματικά κύτταρα. Μια τέτοια στοχευμένη παροχή μπορεί να παρέχεται από τροποποιημένους φορείς που βασίζονται σε ιούς ικανούς να μολύνουν συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Εξετάστε την προσέγγιση που αναπτύχθηκε για τη θεραπεία της κυστικής ίνωσης που ήδη αναφέρθηκε παραπάνω. Δεδομένου ότι οι πνεύμονες είναι μια ανοιχτή κοιλότητα, είναι σχετικά εύκολο να τους χορηγηθούν θεραπευτικά γονίδια. Μια κλωνοποιημένη παραλλαγή του υγιούς γονιδίου εισήχθη σε έναν απενεργοποιημένο αδενοϊό (Εικ. 3.19). Η ιδιαιτερότητα αυτού του τύπου ιού είναι ότι προσβάλλει την επένδυση των πνευμόνων, προκαλώντας κρυολόγημα.

Ρύζι. 3.19. Σχέδιο λήψης φορέα που βασίζεται σε αδενοϊό

Εκτός από τους ρετρό και τους αδενοϊούς, άλλοι τύποι ιών, όπως ο ιός του απλού έρπητα, χρησιμοποιούνται επίσης σε πειράματα γονιδιακής θεραπείας. Ένα χαρακτηριστικό αυτού του δίκλωνου ιού DNA (152 kb) είναι η ικανότητά του να μολύνει ειδικά νευρώνες. Υπάρχουν πολλές γνωστές γενετικές ασθένειες που επηρεάζουν το κεντρικό και το περιφερικό νευρικό σύστημα- όγκοι, μεταβολικές διαταραχές, νευροεκφυλιστικές ασθένειες (νόσος Alzheimer, νόσος Parkinson).

Ιός απλού έρπηταΟ τύπος Ι (HSV) είναι ένας πολύ κατάλληλος φορέας για τη θεραπεία τέτοιων ασθενειών. Το καψίδιο αυτού του ιού συγχωνεύεται με τη μεμβράνη του νευρώνα και το DNA του μεταφέρεται στον πυρήνα. Έχουν προταθεί αρκετές μέθοδοι για τη μεταφορά ενός θεραπευτικού γονιδίου χρησιμοποιώντας φορείς HSV και έχουν πραγματοποιηθεί επιτυχείς δοκιμές σε πειραματόζωα.

Οι ιικοί φορείς έχουν πολλά μειονεκτήματα: υψηλό κόστος, περιορισμένη ικανότητα κλωνοποίησης και δυνατό φλεγμονώδης απόκριση. Έτσι, το 1999, ως αποτέλεσμα μιας ασυνήθιστα ισχυρής ανοσολογικής απόκρισης στην εισαγωγή ενός αδενοϊικού φορέα, ένας 18χρονος εθελοντής που συμμετείχε στις δοκιμές φαρμάκων πέθανε. Το 2002, δύο παιδιά στη Γαλλία ανέπτυξαν μια κατάσταση παρόμοια με τη λευχαιμία κατά τη διάρκεια θεραπείας για ανοσοανεπάρκεια (με την εισαγωγή θεραπευτικών γονιδίων στα βλαστοκύτταρα χρησιμοποιώντας ρετροϊούς).

Ως εκ τούτου, αναπτύσσονται συστήματα παροχής μη ιικών γονιδίων. Ο απλούστερος και πιο αναποτελεσματικός τρόπος είναι η έγχυση πλασμιδικού DNA στους ιστούς. Η δεύτερη προσέγγιση είναι ο βομβαρδισμός ιστών με μικροσωματίδια χρυσού (1-3 μm) συζευγμένα με DNA. Σε αυτή την περίπτωση, τα θεραπευτικά γονίδια εκφράζονται στους ιστούς στόχους και τα προϊόντα τους - θεραπευτικές πρωτεΐνες - εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος. Το κύριο μειονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι η πρόωρη αδρανοποίηση ή καταστροφή αυτών των πρωτεϊνών από συστατικά του αίματος.

Το DNA μπορεί να παραδοθεί συσκευάζοντάς το σε ένα τεχνητό κέλυφος λιπιδίων. Τα σφαιρικά σωματίδια-λιποσώματα που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο διεισδύουν εύκολα στην κυτταρική μεμβράνη. Έχουν δημιουργηθεί λιποσώματα με ποικίλες ιδιότητες, αλλά μέχρι στιγμής η αποτελεσματικότητα μιας τέτοιας παροχής είναι χαμηλή, καθώς τα περισσότερα απόΤο DNA υφίσταται λυσοσωμική αποικοδόμηση. Επίσης, για να παραδοθεί ένα γενετικό κατασκεύασμα, συντίθενται συζυγή DNA με διάφορα μόρια που μπορούν να εξασφαλίσουν την ασφάλειά του, τη στοχευμένη παράδοση και τη διείσδυση στα κύτταρα.

Τα τελευταία χρόνια έχουν πραγματοποιηθεί εντατικά πειράματα για τη δημιουργία ενός τεχνητού 47ου χρωμοσώματος, το οποίο θα επέτρεπε τη συμπερίληψη μεγάλης ποσότητας γενετικού υλικού με ένα πλήρες σύνολο ρυθμιστικών στοιχείων για ένα ή περισσότερα θεραπευτικά γονίδια. Αυτό θα καθιστούσε δυνατή τη χρήση μιας γονιδιωματικής παραλλαγής του θεραπευτικού γονιδίου και έτσι θα εξασφάλιζε τη σταθερότητά του και την αποτελεσματική μακροπρόθεσμη έκφρασή του. Τα πειράματα που έγιναν έδειξαν ότι η δημιουργία ενός τεχνητού ανθρώπινου χρωμοσώματος που περιέχει θεραπευτικά γονίδια είναι αρκετά ρεαλιστική, αλλά δεν είναι ακόμη σαφές πώς να εισαχθεί ένα τόσο τεράστιο μόριο στον πυρήνα ενός κυττάρου στόχου.

Τα κύρια προβλήματα που αντιμετωπίζει η γονιδιακή θεραπεία, εκτός από τον κίνδυνο σοβαρής ανοσολογικής αντίδρασης, είναι οι δυσκολίες μακροχρόνιας αποθήκευσης και λειτουργίας του θεραπευτικού DNA στο σώμα του ασθενούς, η πολυγονικότητα πολλών ασθενειών, γεγονός που τον καθιστά δύσκολο στόχο για το γονίδιο. θεραπεία και τον κίνδυνο χρήσης ιών ως φορέων.

ΣΤΟ. Voinov, T.G. Volova

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο εμφανίζονται όλο και περισσότερα άρθρα σε επιστημονικά περιοδικά σχετικά με ιατρικές κλινικές μελέτες, στις οποίες, με τον ένα ή τον άλλο τρόπο, χρησιμοποιήθηκε μια θεραπεία βασισμένη στην εισαγωγή διαφόρων γονιδίων - γονιδιακή θεραπεία. Αυτή η κατεύθυνση έχει αναπτυχθεί από τόσο καλά ανεπτυγμένους κλάδους της βιολογίας όπως η μοριακή γενετική και η βιοτεχνολογία.

Συχνά, όταν οι συμβατικές (συντηρητικές) μέθοδοι έχουν ήδη δοκιμαστεί, η γονιδιακή θεραπεία είναι αυτή που μπορεί να βοηθήσει τους ασθενείς να επιβιώσουν και ακόμη και να αναρρώσουν πλήρως. Για παράδειγμα, αυτό ισχύει για κληρονομικές μονογονιδιακές ασθένειες, δηλαδή για αυτές που προκαλούνται από ένα ελάττωμα σε ένα μόνο γονίδιο, καθώς και για πολλές άλλες. Ή, για παράδειγμα, η γονιδιακή θεραπεία μπορεί να βοηθήσει και να σώσει ένα άκρο για εκείνους τους ασθενείς που έχουν στενό αγγειακό αυλό κάτω άκρακαι ως αποτέλεσμα, έχει αναπτυχθεί επίμονη ισχαιμία των γύρω ιστών, δηλαδή, αυτοί οι ιστοί παρουσιάζουν σοβαρή έλλειψη ΘΡΕΠΤΙΚΕΣ ουσιεςκαι οξυγόνο, τα οποία φυσιολογικά μεταφέρονται από το αίμα σε όλο το σώμα. Συχνά είναι αδύνατο να αντιμετωπιστούν τέτοιοι ασθενείς με χειρουργικούς χειρισμούς και φάρμακα, αλλά εάν τα κύτταρα αναγκαστούν τοπικά να αποβάλουν περισσότερους πρωτεϊνικούς παράγοντες που θα επηρέαζαν τη διαδικασία σχηματισμού και βλάστησης νέων αγγείων, τότε η ισχαιμία θα γινόταν πολύ λιγότερο έντονη και θα γινόταν πολύ πιο εύκολο για τους ασθενείς να ζήσουν.

γονιδιακή θεραπείαΣήμερα μπορεί να οριστεί ως η θεραπεία ασθενειών με την εισαγωγή γονιδίων στα κύτταρα των ασθενών με στόχο τη στόχευση γονιδιακών ελαττωμάτων ή την παροχή νέων λειτουργιών στα κύτταρα. Οι πρώτες κλινικές δοκιμές μεθόδων γονιδιακής θεραπείας πραγματοποιήθηκαν μόλις στις 22 Μαΐου 1989 με σκοπό τη διάγνωση του καρκίνου. Πρώτα κληρονομική ασθένεια, σε σχέση με τις οποίες εφαρμόστηκαν μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας, αποδείχθηκε ότι ήταν κληρονομική ανοσοανεπάρκεια.

Κάθε χρόνο ο αριθμός των επιτυχώς διενεργούμενων κλινικών δοκιμών της θεραπείας διάφορες ασθένειεςμε τη χρήση της γονιδιακής θεραπείας αυξάνεται, και μέχρι τον Ιανουάριο του 2014 έφτασε τις 2 χιλιάδες.

Ταυτόχρονα, στη σύγχρονη έρευνα για τη γονιδιακή θεραπεία, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι οι συνέπειες του χειρισμού γονιδίων ή του «ανακατεμένου» (ανασυνδυασμένου) DNA in vivo(λατ. κυριολεκτικά «ζωντανός») δεν έχουν μελετηθεί αρκετά. Σε χώρες με το πιο προηγμένο επίπεδο έρευνας σε αυτόν τον τομέα, ειδικά στις Ηνωμένες Πολιτείες, τα ιατρικά πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν αλληλουχίες DNA αίσθησης υπόκεινται σε υποχρεωτική εξέταση στις αρμόδιες επιτροπές και επιτροπές. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, αυτές είναι η Συμβουλευτική Επιτροπή Ανασυνδυασμένου DNA (RAC) και η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) με επακόλουθη υποχρεωτική έγκριση του έργου από τον διευθυντή των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας).

Έτσι, αποφασίσαμε ότι αυτή η θεραπεία βασίζεται στο γεγονός ότι εάν ορισμένοι ιστοί του σώματος δεν έχουν κάποιους μεμονωμένους πρωτεϊνικούς παράγοντες, τότε αυτό μπορεί να διορθωθεί εισάγοντας τα κατάλληλα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη σε αυτούς τους ιστούς και όλα θα γίνουν λίγο πολύ υπέροχα. . Δεν θα είναι δυνατή η εισαγωγή των ίδιων των πρωτεϊνών, γιατί το σώμα μας θα αντιδράσει αμέσως ανοσολογική απόκριση, και η διάρκεια της δράσης θα ήταν ανεπαρκής. Τώρα πρέπει να αποφασίσουμε για τη μέθοδο μεταφοράς του γονιδίου στα κύτταρα.

Μεταμόλυνση κύτταρα

Αρχικά, αξίζει να εισαγάγουμε ορισμούς ορισμένων όρων.

Η μεταφορά γονιδίων πραγματοποιείται από διάνυσμαείναι ένα μόριο DNA που χρησιμοποιείται ως " όχημα» για την τεχνητή μεταφορά γενετικής πληροφορίας στο κύτταρο. Υπάρχουν πολλοί τύποι φορέων: πλασμίδιο, ιικός, καθώς και κοσμίδια, φασμίδια, τεχνητά χρωμοσώματα κ.λπ. Είναι θεμελιώδους σημασίας οι φορείς (ιδιαίτερα οι πλασμιδικοί φορείς) να έχουν τις χαρακτηριστικές τους ιδιότητες:

1. Προέλευση αντιγραφής (ori)- η αλληλουχία νουκλεοτιδίων από την οποία αρχίζει ο διπλασιασμός του DNA. Εάν το DNA του φορέα δεν μπορεί να διπλασιαστεί (αντιγραφεί), τότε το απαραίτητο θεραπευτικό αποτέλεσμαδεν θα επιτευχθεί, γιατί απλά θα διασπαστεί γρήγορα από τα ενδοκυτταρικά ένζυμα νουκλεάσης, και λόγω της έλλειψης προτύπων, τελικά θα σχηματιστούν πολύ λιγότερα μόρια πρωτεΐνης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα σημεία είναι συγκεκριμένα για κάθε βιολογικό είδος, δηλαδή εάν το DNA του φορέα υποτίθεται ότι λαμβάνεται με την αναπαραγωγή του σε μια βακτηριακή καλλιέργεια (και όχι μόνο χημική σύνθεση, το οποίο είναι συνήθως πολύ πιο ακριβό), τότε θα απαιτηθούν δύο ξεχωριστές πηγές αντιγραφής - για ανθρώπους και για βακτήρια.

2. Τοποθεσίες περιορισμών- συγκεκριμένες σύντομες αλληλουχίες (συνήθως παλινδρομικές), οι οποίες αναγνωρίζονται από ειδικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες περιορισμού) και κόβονται από αυτά με συγκεκριμένο τρόπο - με το σχηματισμό «κολλωδών άκρων» (Εικ. 1).

Εικ.1 Σχηματισμός «κολλωδών άκρων» με τη συμμετοχή περιορισμών

Αυτές οι θέσεις είναι απαραίτητες για τη διασύνδεση του DNA του φορέα (το οποίο, στην πραγματικότητα, είναι ένα "κενό") με τα επιθυμητά θεραπευτικά γονίδια σε ένα μόνο μόριο. Ένα τέτοιο μόριο διασυνδεδεμένο από δύο ή περισσότερα μέρη ονομάζεται "ανασυνδυασμένο".

3. Είναι σαφές ότι θα θέλαμε να αποκτήσουμε εκατομμύρια αντίγραφα του μορίου του ανασυνδυασμένου DNA. Και πάλι, αν έχουμε να κάνουμε με καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων, τότε αυτό το DNA πρέπει να απομονωθεί περαιτέρω. Το πρόβλημα είναι ότι δεν θα καταπιούν όλα τα βακτήρια το μόριο που χρειαζόμαστε, μερικά όχι. Προκειμένου να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των δύο ομάδων, εισάγονται στο DNA του φορέα επιλεκτικούς δείκτες- περιοχές αντίστασης σε ορισμένες χημικά; Τώρα, εάν αυτές οι ίδιες ουσίες προστεθούν στο περιβάλλον, τότε μόνο όσες είναι ανθεκτικές σε αυτές θα επιβιώσουν και οι υπόλοιπες θα πεθάνουν.

Και τα τρία αυτά συστατικά μπορούν να παρατηρηθούν στο πρώτο πλασμίδιο που συντέθηκε τεχνητά (Εικ. 2).

Εικ.2

Η ίδια η διαδικασία εισαγωγής ενός πλασμιδικού φορέα σε ορισμένα κύτταρα ονομάζεται επιμόλυνση. Ένα πλασμίδιο είναι ένα αρκετά κοντό και συνήθως κυκλικό μόριο DNA που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα ενός βακτηριακού κυττάρου. Τα πλασμίδια δεν σχετίζονται με το βακτηριακό χρωμόσωμα, μπορούν να αναπαραχθούν ανεξάρτητα από αυτό, μπορούν να πεταχτούν από το βακτήριο σε περιβάλλονή, αντίθετα, να απορροφηθεί (η διαδικασία της απορρόφησης - μεταμόρφωση). Με τη βοήθεια πλασμιδίων, τα βακτήρια μπορούν να ανταλλάξουν γενετικές πληροφορίες, για παράδειγμα, να μεταφέρουν αντοχή σε ορισμένα αντιβιοτικά.

Τα πλασμίδια υπάρχουν στα βακτήρια in vivo. Αλλά κανείς δεν μπορεί να εμποδίσει έναν ερευνητή να συνθέσει τεχνητά ένα πλασμίδιο που θα έχει τις ιδιότητες που χρειάζεται, θα ράψει ένα γονίδιο σε αυτό και θα το εισάγει σε ένα κύτταρο. Διαφορετικά ένθετα μπορούν να εισαχθούν στο ίδιο πλασμίδιο .

Μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας

Υπάρχουν δύο κύριες προσεγγίσεις που διαφέρουν ως προς τη φύση των κυττάρων-στόχων:

1. Εμβρυϊκό, στο οποίο ξένο DNA εισάγεται στο ζυγώτη (γονιμοποιημένο ωάριο) ή στο έμβρυο πρώιμο στάδιοανάπτυξη; Σε αυτή την περίπτωση, αναμένεται ότι το εισαγόμενο υλικό θα εισέλθει σε όλα τα κύτταρα του δέκτη (ακόμα και στα γεννητικά κύτταρα, διασφαλίζοντας έτσι τη μετάδοση στην επόμενη γενιά). Στη χώρα μας ουσιαστικά απαγορεύεται.

2. Σωματικό, στο οποίο το γενετικό υλικό εισάγεται στα μη σεξουαλικά κύτταρα του ήδη γεννημένου και δεν μεταδίδεται στα γεννητικά κύτταρα.

Γονιδιακή θεραπεία in vivoβασίζεται στην άμεση εισαγωγή κλωνοποιημένων (πολλαπλασιασμένων) και ειδικά συσκευασμένων αλληλουχιών DNA σε ορισμένους ιστούς του ασθενούς. Ιδιαίτερα πολλά υποσχόμενη για τη θεραπεία γονιδιακών ασθενειών in vivo είναι η εισαγωγή γονιδίων που χρησιμοποιούν αεροζόλ ή ενέσιμα εμβόλια. Η γονιδιακή θεραπεία με αεροζόλ αναπτύσσεται, κατά κανόνα, για τη θεραπεία πνευμονικών παθήσεων (κυστική ίνωση, καρκίνος του πνεύμονα).

Η ανάπτυξη ενός προγράμματος γονιδιακής θεραπείας προηγείται από πολλά στάδια. Αυτό περιλαμβάνει μια ενδελεχή ανάλυση της ειδικής για τον ιστό έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου (δηλαδή, σύνθεση στη γονιδιακή μήτρα κάποιας πρωτεΐνης σε έναν συγκεκριμένο ιστό) και την αναγνώριση του πρωτογενούς βιοχημικού ελαττώματος και τη μελέτη της δομής, της λειτουργίας και της λειτουργίας και ενδοκυτταρική κατανομή του πρωτεϊνικού προϊόντος της, καθώς και βιοχημική ανάλυσηπαθολογική διαδικασία. Όλα αυτά τα δεδομένα λαμβάνονται υπόψη κατά τη σύνταξη του κατάλληλου ιατρικού πρωτοκόλλου.

Είναι σημαντικό κατά την κατάρτιση σχημάτων για τη γονιδιακή διόρθωση, η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, ο βαθμός διόρθωσης του πρωτογενούς βιοχημικού ελαττώματος υπό συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας ( in vitro,"in vitro") και, το πιο σημαντικό, in vivoσε ζωικά βιολογικά μοντέλα. Μόνο τότε μπορεί να ξεκινήσει το πρόγραμμα κλινικών δοκιμών. .

Άμεση παράδοση και κυτταρικοί φορείς θεραπευτικών γονιδίων

Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την εισαγωγή ξένου DNA σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο: ορισμένες εξαρτώνται από τη φυσική επεξεργασία (ηλεκτροδιάτρηση, μαγνητομόνωση κ.λπ.), άλλες από την εφαρμογή χημικά υλικάή βιολογικά σωματίδια (π.χ. ιοί) που χρησιμοποιούνται ως φορείς. Αξίζει να αναφέρουμε αμέσως ότι οι χημικές και φυσικές μέθοδοι συνήθως συνδυάζονται (για παράδειγμα, ηλεκτροδιάτρηση + περιτύλιξη DNA με λιποσώματα)

Άμεσες Μέθοδοι

1. Η επιμόλυνση με χημική βάση μπορεί να ταξινομηθεί σε διάφορους τύπους: με χρήση ουσίας κυκλοδεξτρίνης, πολυμερών, λιποσωμάτων ή νανοσωματιδίων (με ή χωρίς χημική ή ιική λειτουργικότητα, δηλαδή τροποποίηση επιφάνειας).
α) Μία από τις φθηνότερες μεθόδους είναι η χρήση φωσφορικού ασβεστίου. Αυξάνει την αποτελεσματικότητα της ενσωμάτωσης του DNA στα κύτταρα κατά 10-100 φορές. Το DNA σχηματίζει ένα ισχυρό σύμπλεγμα με το ασβέστιο, το οποίο εξασφαλίζει την αποτελεσματική απορρόφησή του. Το μειονέκτημα είναι ότι μόνο περίπου το 1 - 10% του DNA φτάνει στον πυρήνα. Μέθοδος που χρησιμοποιείται in vitroνα μεταφέρει DNA σε ανθρώπινα κύτταρα (Εικ. 3).

Εικ.3

β) Η χρήση πολύ διακλαδισμένων οργανικών μορίων - δενδριμερούς, για τη σύνδεση του DNA και τη μεταφορά του στο κύτταρο (Εικ. 4);

Εικ.4

γ) Μια πολύ αποτελεσματική μέθοδος για τη διαμόλυνση DNA είναι η εισαγωγή της μέσω λιποσωμάτων - μικρών σωμάτων που περιβάλλονται από μεμβράνη που μπορούν να συγχωνευτούν με την κυτταρική κυτταροπλασματική μεμβράνη (CPM), η οποία είναι ένα διπλό στρώμα λιπιδίων. Για τα ευκαρυωτικά κύτταρα, η επιμόλυνση είναι πιο αποτελεσματική με κατιονικά λιποσώματα επειδή τα κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε αυτά. Η διαδικασία έχει το δικό της όνομα - λιπομόλυνση. Αυτή η μέθοδος θεωρείται μία από τις ασφαλέστερες σήμερα. Τα λιποσώματα είναι μη τοξικά και μη ανοσογόνα. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της μεταφοράς γονιδίων χρησιμοποιώντας λιποσώματα είναι περιορισμένη, καθώς το DNA που εισάγεται από αυτά στα κύτταρα συνήθως συλλαμβάνεται αμέσως από τα λυσοσώματα και καταστρέφεται. Η εισαγωγή του DNA στα ανθρώπινα κύτταρα με τη βοήθεια λιποσωμάτων είναι ο βασικός άξονας της θεραπείας σήμερα. in vivo(εικ.5);

Εικ.5

δ) Μια άλλη μέθοδος είναι η χρήση κατιονικών πολυμερών όπως η διαιθυλαμινοαιθυλ-δεξτράνη ή η πολυαιθυλενοϊμίνη. Αρνητικά φορτισμένα μόρια DNA συνδέονται με θετικά φορτισμένα πολυκατιόντα και αυτό το σύμπλεγμα στη συνέχεια εισέρχεται στο κύτταρο με ενδοκύττωση. Αλλαγές DEAE-δεξτράνης φυσικές ιδιότητεςπλασματική μεμβράνη και διεγείρει την πρόσληψη αυτού του συμπλέγματος από το κύτταρο. Το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι η DEAE-δεξτράνη σε υψηλές συγκεντρώσειςτοξικός. Η μέθοδος δεν έχει λάβει διανομή στη γονιδιακή θεραπεία.

ε) Με τη βοήθεια ιστονών και άλλων πυρηνικών πρωτεϊνών. Αυτές οι πρωτεΐνες, που περιέχουν πολλά θετικά φορτισμένα αμινοξέα (Lys, Arg), υπό φυσικές συνθήκες συμβάλλουν στη συμπαγή συσκευασία μιας μακριάς αλυσίδας DNA σε έναν σχετικά μικρό κυτταρικό πυρήνα.

2. Φυσικές μέθοδοι:

α) Η ηλεκτροδιάτρηση είναι μια πολύ δημοφιλής μέθοδος. Η στιγμιαία αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης επιτυγχάνεται λόγω του γεγονότος ότι τα κύτταρα υπόκεινται σε σύντομες εκθέσεις σε έντονο ηλεκτρικό πεδίο. Έχει αποδειχθεί ότι υπό βέλτιστες συνθήκες ο αριθμός των μετασχηματισμένων μπορεί να φτάσει το 80% των επιζώντων κυττάρων. Επί του παρόντος δεν χρησιμοποιείται σε ανθρώπους (Εικ. 6).

Εικ.6

β) "Cell squeezing" - μια μέθοδος που εφευρέθηκε το 2013. Σας επιτρέπει να μεταφέρετε μόρια στα κύτταρα με "μαλακή συμπίεση" της κυτταρικής μεμβράνης. Η μέθοδος εξαλείφει την πιθανότητα τοξικότητας ή λανθασμένου χτυπήματος στο στόχο, καθώς δεν εξαρτάται από εξωτερικά υλικά ή ηλεκτρικά πεδία.

γ) Sonoporation - μια μέθοδος τεχνητής μεταφοράς ξένου DNA σε κύτταρα με την έκθεσή τους σε υπερήχους, που προκαλεί το άνοιγμα των πόρων στην κυτταρική μεμβράνη.
δ) Οπτική επιμόλυνση - μέθοδος κατά την οποία δημιουργείται μια μικροσκοπική οπή στη μεμβράνη (διάμετρος περίπου 1 μm) χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ υψηλής εστίασης.
ε) Υδροδυναμική επιμόλυνση - μέθοδος παροχής γενετικών κατασκευών, πρωτεϊνών κ.λπ. με ελεγχόμενη αύξηση της πίεσης στα τριχοειδή αγγεία και το διάμεσο υγρό, που προκαλεί βραχυπρόθεσμη αύξηση της διαπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών και το σχηματισμό προσωρινών πόρων σε αυτές. Πραγματοποιείται με ταχεία ένεση στον ιστό, ενώ η παράδοση είναι μη ειδική. Αποτελεσματικότητα παροχής για σκελετικούς μύες - 22 έως 60% ;

στ) Μικροέγχυση DNA - εισαγωγή στον πυρήνα ζωικών κυττάρων με χρήση λεπτών γυάλινων μικροσωληνίσκων (d=0,1-0,5 μm). Το μειονέκτημα είναι η πολυπλοκότητα της μεθόδου, η πιθανότητα καταστροφής του πυρήνα ή του DNA είναι υψηλή. ένας περιορισμένος αριθμός κυττάρων μπορεί να μετασχηματιστεί. Δεν χρησιμοποιείται για ανθρώπους.

3. Μέθοδοι που βασίζονται σε σωματίδια.

α) Μια άμεση προσέγγιση στη διαμόλυνση είναι το γονιδιακό πιστόλι, στο οποίο το DNA συζεύγνυται σε ένα νανοσωματίδιο με αδρανή στερεά (συνήθως χρυσό, βολφράμιο), το οποίο στη συνέχεια «πυροβολεί» κατευθύνεται στους πυρήνες των κυττάρων-στόχων. Αυτή η μέθοδος εφαρμόζεται in vitroκαι in vivoγια την εισαγωγή γονιδίων, ειδικότερα, στα κύτταρα των μυϊκών ιστών, για παράδειγμα, σε μια ασθένεια όπως η μυϊκή δυστροφία Duchenne. Το μέγεθος των σωματιδίων χρυσού είναι 1-3 μικρά (Εικ. 7).

Εικ.7

β) Μαγνητοσόλυνση - μια μέθοδος που χρησιμοποιεί τις δυνάμεις του μαγνητισμού για να παραδώσει DNA στα κύτταρα στόχους. Αρχικά, τα νουκλεϊκά οξέα (NA) συνδέονται με μαγνητικά νανοσωματίδια και στη συνέχεια, υπό τη δράση ενός μαγνητικού πεδίου, τα σωματίδια οδηγούνται στο κύτταρο. Η αποτελεσματικότητα είναι σχεδόν 100%, σημειώνεται προφανής μη τοξικότητα. Ήδη μετά από 10-15 λεπτά, τα σωματίδια καταγράφονται στο κελί - αυτό είναι πολύ πιο γρήγορο από άλλες μεθόδους.
γ) Impalefection (impalefection, "impalement", κιτ. "impaling" + "infection") - μέθοδος παράδοσης που χρησιμοποιεί νανοϋλικά όπως νανοσωλήνες άνθρακα και νανοΐνες. Σε αυτή την περίπτωση, τα κύτταρα τρυπούνται κυριολεκτικά από ένα στρώμα νανοϊνιδίων. Το πρόθεμα «nano» χρησιμοποιείται για να δηλώσει τα πολύ μικρά μεγέθη τους (εντός δισεκατομμυριοστών του μέτρου) (Εικ. 8).

Εικ.8

Ξεχωριστά, αξίζει να επισημανθεί μια τέτοια μέθοδος όπως η επιμόλυνση RNA: δεν παρέχεται DNA στο κύτταρο, αλλά μόρια RNA - οι «διάδοχοί» τους στην αλυσίδα βιοσύνθεσης πρωτεϊνών. ταυτόχρονα, ενεργοποιούνται ειδικές πρωτεΐνες που κόβουν το RNA σε μικρά θραύσματα - τα λεγόμενα. μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA). Αυτά τα θραύσματα συνδέονται με άλλες πρωτεΐνες και, στο τέλος, αυτό οδηγεί σε αναστολή της έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων από το κύτταρο. Έτσι, είναι δυνατό να αποκλειστεί η δράση εκείνων των γονιδίων στο κύτταρο που δυνητικά κάνουν περισσότερο κακό παρά καλό αυτή τη στιγμή. Η επιμόλυνση RNA έχει βρει ευρεία εφαρμογή, ιδιαίτερα στην ογκολογία.

Λαμβάνονται υπόψη οι βασικές αρχές της παράδοσης γονιδίων χρησιμοποιώντας φορείς πλασμιδίου. Τώρα μπορούμε να προχωρήσουμε στην εξέταση των ιογενών μεθόδων. Οι ιοί είναι μη κυτταρικές μορφές ζωής, πιο συχνά ένα μόριο νουκλεϊκού οξέος (DNA ή RNA) τυλιγμένο σε μια πρωτεϊνική επικάλυψη. Εάν αποκόψουμε από το γενετικό υλικό του ιού όλες εκείνες τις αλληλουχίες που προκαλούν την εμφάνιση ασθενειών, τότε ολόκληρος ο ιός μπορεί επίσης να μετατραπεί επιτυχώς σε «όχημα» για το γονίδιο μας.

Η διαδικασία εισαγωγής DNA σε ένα κύτταρο, με τη μεσολάβηση ενός ιού, ονομάζεται μεταγωγή.
Στην πράξη, οι ρετροϊοί, οι αδενοϊοί και οι αδενοϊοί (AAVs) χρησιμοποιούνται συχνότερα. Αρχικά, αξίζει τον κόπο να καταλάβουμε ποιος θα πρέπει να είναι ο ιδανικός υποψήφιος για μεταγωγή μεταξύ των ιών. Τα κριτήρια είναι ότι πρέπει να είναι:

σταθερός;
. ικανότητα, δηλαδή, να περιέχει επαρκή ποσότητα DNA.
. αδρανής σε σχέση με τις μεταβολικές οδούς του κυττάρου.
. ακριβής - ιδανικά, θα πρέπει να ενσωματώνει το γονιδίωμά του σε έναν συγκεκριμένο τόπο του γονιδιώματος του πυρήνα του ξενιστή κ.λπ.

Στην πραγματική ζωή, είναι πολύ δύσκολο να συνδυαστούν τουλάχιστον μερικά σημεία, έτσι ώστε συνήθως η επιλογή γίνεται όταν εξετάζουμε κάθε μεμονωμένη περίπτωση ξεχωριστά (Εικ. 9).

Εικ.9

Από τους τρεις πιο χρησιμοποιούμενους ιούς που αναφέρονται, ο AAV είναι ο ασφαλέστερος και ταυτόχρονα ο πιο ακριβής. Σχεδόν το μόνο τους μειονέκτημα είναι η σχετικά μικρή τους χωρητικότητα (περίπου 4800 bp), η οποία, ωστόσο, αποδεικνύεται επαρκής για πολλά γονίδια .

Εκτός από τις παραπάνω μεθόδους, η γονιδιακή θεραπεία χρησιμοποιείται συχνά σε συνδυασμό με την κυτταρική θεραπεία: πρώτα, μια καλλιέργεια ορισμένων ανθρώπινων κυττάρων φυτεύεται σε ένα θρεπτικό μέσο και στη συνέχεια τα απαραίτητα γονίδια εισάγονται στα κύτταρα με τον ένα ή τον άλλο τρόπο, που καλλιεργούνται για λίγο χρόνο και μεταμοσχεύονται ξανά στον οργανισμό ξενιστή. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα μπορούν να επιστρέψουν στις κανονικές τους ιδιότητες. Έτσι, για παράδειγμα, τα ανθρώπινα λευκά αιμοσφαίρια (λευκοκύτταρα) τροποποιήθηκαν στη λευχαιμία (Εικ. 10).

Εικ.10

Η μοίρα του γονιδίου αφού εισέλθει στο κύτταρο

Δεδομένου ότι όλα είναι λίγο πολύ ξεκάθαρα με τους ιικούς φορείς λόγω της ικανότητάς τους να παρέχουν πιο αποτελεσματικά γονίδια στον τελικό στόχο - τον πυρήνα, θα σταθούμε στην τύχη του πλασμιδικού φορέα.

Σε αυτό το στάδιο, έχουμε επιτύχει ότι το DNA έχει περάσει τον πρώτο μεγάλο φραγμό - την κυτταροπλασματική μεμβράνη του κυττάρου.

Περαιτέρω, σε συνδυασμό με άλλες ουσίες, καλυμμένες ή όχι, πρέπει να πετύχει πυρήνα του κυττάρουέτσι ώστε ένα ειδικό ένζυμο - RNA πολυμεράση - να συνθέτει ένα μόριο αγγελιαφόρου RNA (mRNA) σε ένα πρότυπο DNA (αυτή η διαδικασία ονομάζεται μεταγραφή). Μόνο μετά από αυτό, το mRNA θα εισέλθει στο κυτταρόπλασμα, θα σχηματίσει ένα σύμπλεγμα με τα ριβοσώματα και, σύμφωνα με γενετικός κώδικαςσυντίθεται ένα πολυπεπτίδιο - για παράδειγμα, ο αγγειακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ο οποίος θα αρχίσει να εκτελεί μια συγκεκριμένη θεραπευτική λειτουργία (σε αυτή την περίπτωση, θα ξεκινήσει η διαδικασία σχηματισμού αγγειακής διακλάδωσης σε ιστό επιρρεπή σε ισχαιμία).

Όσον αφορά την έκφραση των εισαγόμενων γονιδίων στον επιθυμητό κυτταρικό τύπο, αυτό το πρόβλημα επιλύεται με τη βοήθεια μεταγραφικών ρυθμιστικών στοιχείων. Ο ιστός στον οποίο εμφανίζεται η έκφραση συχνά καθορίζεται από το συνδυασμό ενός ειδικού για τον ιστό ενισχυτή (αλληλουχία «ενίσχυσης») με έναν συγκεκριμένο προαγωγέα (αλληλουχία νουκλεοτιδίων από την οποία ξεκινά τη σύνθεση της RNA πολυμεράσης), που μπορεί να είναι επαγώγιμη. . Είναι γνωστό ότι η γονιδιακή δραστηριότητα μπορεί να ρυθμιστεί in vivoεξωτερικά σήματα, και δεδομένου ότι οι ενισχυτές μπορούν να λειτουργήσουν με οποιοδήποτε γονίδιο, μπορούν επίσης να εισαχθούν μονωτές σε φορείς που βοηθούν τον ενισχυτή να λειτουργεί ανεξάρτητα από τη θέση του και μπορούν να συμπεριφέρονται ως λειτουργικοί φραγμοί μεταξύ των γονιδίων. Κάθε ενισχυτής περιέχει ένα σύνολο θέσεων δέσμευσης για την ενεργοποίηση ή την καταστολή πρωτεϊνικών παραγόντων. Οι προαγωγείς μπορούν επίσης να ρυθμίσουν το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Για παράδειγμα, υπάρχουν προαγωγείς που είναι ευαίσθητοι στη μεταλλοθειονεΐνη ή στη θερμοκρασία. ορμονοκίνητοι προαγωγείς.

Η έκφραση ενός γονιδίου εξαρτάται από τη θέση του στο γονιδίωμα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι υπάρχουσες ιογενείς μέθοδοι οδηγούν μόνο σε τυχαία εισαγωγή ενός γονιδίου στο γονιδίωμα. Για την εξάλειψη μιας τέτοιας εξάρτησης, κατά την κατασκευή φορέων, το γονίδιο παρέχεται με γνωστές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που επιτρέπουν στο γονίδιο να εκφραστεί ανεξάρτητα από τη θέση εισαγωγής του στο γονιδίωμα.

Ο απλούστερος τρόπος ρύθμισης της έκφρασης διαγονιδίων είναι να του παρέχουμε έναν υποκινητή δείκτη που είναι ευαίσθητος σε ένα φυσιολογικό σήμα όπως η απελευθέρωση γλυκόζης ή η υποξία. Τέτοια «ενδογενή» συστήματα ελέγχου μπορεί να είναι χρήσιμα σε ορισμένες καταστάσεις, όπως ο εξαρτώμενος από τη γλυκόζη έλεγχος της παραγωγής ινσουλίνης. Πιο αξιόπιστα και ευέλικτα είναι τα «εξωγενή» συστήματα ελέγχου, όταν η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται φαρμακολογικά με την εισαγωγή ενός μικρού μορίου φαρμάκου. Επί του παρόντος, είναι γνωστά 4 κύρια συστήματα ελέγχου - ρυθμιζόμενα από τετρακυκλίνη (Tet), ένα στεροειδές εντόμου, την εκδυζόνη ή τα ανάλογα της, το αντιπρογεστερονικό φάρμακο maifpristone (RU486) και χημικούς διμεριστές όπως η ραπαμυκίνη και τα ανάλογα της. Όλες περιλαμβάνουν στρατολόγηση που εξαρτάται από το φάρμακο του τομέα ενεργοποίησης μεταγραφής στον κύριο προαγωγέα που οδηγεί το επιθυμητό γονίδιο, αλλά διαφέρουν ως προς τους μηχανισμούς αυτής της στρατολόγησης. .

συμπέρασμα

Μια ανασκόπηση των δεδομένων οδηγεί στο συμπέρασμα ότι, παρά τις προσπάθειες πολλών εργαστηρίων στον κόσμο, όλα είναι ήδη γνωστά και ελεγμένα in vivoκαι in vitroδιανυσματικά συστήματα απέχουν πολύ από το να είναι τέλεια . Εάν το πρόβλημα της παράδοσης ξένου DNA in vitroπρακτικά λυθεί και η παράδοση του σε κύτταρα στόχους διαφορετικών ιστών in vivoεπιλύθηκαν επιτυχώς (κυρίως δημιουργώντας κατασκευές που φέρουν πρωτεΐνες υποδοχέα, συμπεριλαμβανομένων αντιγόνων ειδικά για ορισμένους ιστούς), στη συνέχεια άλλα χαρακτηριστικά των υπαρχόντων συστημάτων φορέων - σταθερότητα ενσωμάτωσης, ρυθμισμένη έκφραση, ασφάλεια - εξακολουθούν να χρειάζονται σοβαρές βελτιώσεις.

Πρώτα απ 'όλα, αφορά τη σταθερότητα της ολοκλήρωσης. Μέχρι στιγμής, η ενσωμάτωση στο γονιδίωμα έχει επιτευχθεί μόνο με τη χρήση ρετροϊικών ή αδενο-σχετιζόμενων φορέων. Η αποτελεσματικότητα της σταθερής ολοκλήρωσης μπορεί να αυξηθεί με τη βελτίωση των γονιδιακών κατασκευών όπως τα συστήματα που προκαλούνται από υποδοχείς ή με τη δημιουργία επαρκώς σταθερών επισωματικών φορέων (δηλαδή, δομές DNA ικανές για μακροχρόνια παραμονή εντός των πυρήνων). Πρόσφατα, έχει δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στη δημιουργία φορέων που βασίζονται σε τεχνητά χρωμοσώματα θηλαστικών. Λόγω της παρουσίας των βασικών δομικών στοιχείων των συνηθισμένων χρωμοσωμάτων, τέτοια μίνι-χρωμοσώματα διατηρούνται στα κύτταρα για μεγάλο χρονικό διάστημα και είναι σε θέση να φέρουν γονίδια πλήρους μεγέθους (γονιδιωματικά) και τα φυσικά ρυθμιστικά τους στοιχεία, τα οποία είναι απαραίτητα για τη σωστή λειτουργία του γονιδίου, στον σωστό ιστό και τη σωστή στιγμή.

Η γονιδιακή και κυτταρική θεραπεία ανοίγει λαμπρές προοπτικές για την αποκατάσταση χαμένων κυττάρων και ιστών και τον σχεδιασμό της γενετικής μηχανικής οργάνων, που αναμφίβολα θα επεκτείνει σημαντικά το οπλοστάσιο των μεθόδων για τη βιοϊατρική έρευνα και θα δημιουργήσει νέες ευκαιρίες για τη διατήρηση και παράταση της ανθρώπινης ζωής.

30 Αυγούστου 2017 τρόφιμακαι ο Οργανισμός Φαρμάκων (FDA) ενέκρινε την πρώτη στον κόσμο γονιδιακή θεραπεία για τον καρκίνο του αίματος. Πρόκειται για το Kymriah (tisagenlecleucel) της Novartis Pharmaceuticals, το οποίο βασίζεται στην τεχνολογία CAR-T και προορίζεται για τη θεραπεία της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας των Β κυττάρων σε παιδιά και νεαρούς ενήλικες έως 25 ετών που είναι ανθεκτικοί σε άλλες θεραπείες ή έχουν υποτροπή της νόσου.

Η χρήση της τεχνολογίας επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9 ανοίγει νέες δυνατότητες στη γονιδιακή θεραπεία. Το CRISPR/Cas9 σας επιτρέπει να αλλάζετε με μεγάλη ακρίβεια και ασφάλεια το DNA των κυττάρων. Και αν συνδυάσουμε την τεχνολογία CRISPR/Cas9 με παράδοση με χρήση αδενο-σχετιζόμενων ιών, τότε αυτό, προφανώς, θα επιτρέψει μια συστηματική επίδραση στο σώμα και θα αλλάξει με απόλυτη ασφάλεια το γονιδίωμα ενός πολύ μεγάλου αριθμού κυττάρων.

Και το 2016, γενετιστές από το Πανεπιστήμιο Duke (ΗΠΑ) ανακοίνωσαν ότι για πρώτη φορά στην ιστορία κατάφεραν να πραγματοποιήσουν επιτυχώς γονιδιακή θεραπεία σε ενήλικο θηλαστικό (ποντίκι) και να το θεραπεύσουν από μια γενετική ασθένεια που σχετίζεται με μυϊκή δυστροφία. Για αυτό, μια τροποποιημένη έκδοση του συγκριτικά νέα τεχνολογίαεπεξεργασία γονιδίων CRISPR/Cas9. Η τεχνολογία επεξεργασίας γονιδίων CRISPR/Cas9 περιλαμβάνει τη χρήση ενός αδενο-συσχετιζόμενου ιού για να βοηθήσει στην παράδοση γενετικού υλικού στον προορισμό του. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία, έχουν πραγματοποιηθεί επιτυχημένα πειράματα για την επεξεργασία των γονιδίων μεμονωμένων κυττάρων σε δοκιμαστικούς σωλήνες και σε έμβρυα μονοκυττάρων. Δυστυχώς, μέχρι στιγμής η πιθανότητα γενετικής χειραγώγησης σε ανθρώπινα έμβρυα αποτελεί θέμα σφοδρής διαμάχης.

Το CRISPR/Cas ξεπέρασε κάθε προσδοκία. Επέτρεψε, με ελάχιστο αριθμό σφαλμάτων, τόσο να «απενεργοποιηθούν» τα απαραίτητα γονίδια και να ενσωματωθούν νέα γονίδια σε αυστηρά καθορισμένες περιοχές του γονιδιώματος.

Τον Δεκέμβριο του 2015, η ερευνητική ομάδα του Φενγκ Τζανγκ τροποποίησε αυτό το σύστημα έτσι ώστε να είναι εντελώς απαλλαγμένο από σφάλματα, το οποίο δημοσιεύτηκε στο κορυφαίο επιστημονικό περιοδικόΕπιστήμη. Οι επιστήμονες αντικατέστησαν 3 αμινοξέα (τα δομικά στοιχεία που συνθέτουν την πρωτεΐνη) στην ενδονουκλεάση Cas9, μετά την οποία ο αριθμός των σφαλμάτων σε ένα τέτοιο σύστημα μειώθηκε σχεδόν στο μηδέν.

Η χρήση του CRISP/Cas9 είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη γονιδιακή θεραπεία της γήρανσης, όπου απαιτείται να επηρεάσει τις οδούς μακροζωίας που είναι κοινές στα περισσότερα κύτταρα του σώματος. Μέχρι το 2015, δεν είχαν διεξαχθεί κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους για τη γονιδιακή θεραπεία για τη γήρανση, κάτι που δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς η γήρανση δεν έχει ακόμη αναγνωριστεί ως ασθένεια.

Επιπλέον, η γονιδιακή θεραπεία για τη γήρανση είναι ακόμα ένας πολύ νέος και αναπτυσσόμενος τομέας. Τώρα όλες οι μελέτες για τη γονιδιακή θεραπεία της γήρανσης πραγματοποιούνται σε ποντίκια μοντέλα, αρουραίους, πιθήκους και καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων - κύτταρα in vitro.

Όλες οι προσεγγίσεις στη γονιδιακή θεραπεία της γήρανσης χωρίζονται σε εκείνες όπου το γονίδιο μακροζωίας παρέχεται στο σώμα και σε εκείνες όπου εισάγονται μικρά RNA που «απενεργοποιούν» το γονίδιο ή την οδό γήρανσης. Δηλαδή στην πρώτη περίπτωση εισάγεται κάτι χρήσιμο για μακροζωία και στη δεύτερη απενεργοποιείται το βλαβερό. Αυστηρά μιλώντας, έχουν γίνει μόνο δύο μελέτες γονιδιακής θεραπείας για τη γήρανση σε θηλαστικά μέχρι το 2015.

Πολύ περισσότερα έργαμοντέλο γονιδιακής θεραπείας σε διαγονιδιακά ποντίκια. Σε τέτοιες μελέτες, το θεραπευτικό γονίδιο δεν μεταφέρεται στο σώμα ενός ενήλικου ποντικού, αλλά με τη βοήθεια της γενετικής μηχανικής δημιουργούνται ποντίκια των οποίων το γονιδίωμα έχει αλλάξει από τη γέννηση. Όπως και η γονιδιακή θεραπεία, αυτή σας επιτρέπει να εξερευνήσετε πώς η αύξηση ή η μείωση της δραστηριότητας διαφορετικών γονιδίων επηρεάζει τη διάρκεια ζωής και τη γήρανση του σώματος.

Ας ρίξουμε μια ματιά στο τι θα μπορούσε θεωρητικά να κάνει η γονιδιακή θεραπεία και η γενετική μηχανική για την καταπολέμηση της γήρανσης.

Το πλεονέκτημα της γονιδιακής θεραπείας έναντι άλλων μεθόδων επέκτασης της ζωής

Επομένως, αν μιλάμε για μετάφραση της έρευνας για την παράταση της ζωής στον άνθρωπο, τότε η γονιδιακή θεραπεία έχει απόλυτο πλεονέκτημα, αφού δεν μειώνει την ποιότητα ζωής λόγω της ανάγκης μόνιμη θεραπεία- ακολουθήστε μια καθημερινή διατροφή ή χρησιμοποιήστε συνεχώς γεροπροστατευτικά ή άλλα φάρμακα. Επίσης, η γονιδιακή θεραπεία είναι ιδιαίτερα στοχευμένη και ως εκ τούτου έχει τη δυνατότητα για λιγότερες παρενέργειες.

Εκτός, φάρμακαέχουν περιορισμένη βιοδιαθεσιμότητα σε διάφορους ιστούς και όργανα.

Η εισαγωγή του γονιδίου της τελομεράσης (TERT) σε ποντίκια άγριου τύπου δύο ετών (40-50 ετών σε ανθρώπινο επίπεδο) με μία μόνο ένεση αυξάνει το μήκος των τελομερών και παρατείνει τη ζωή τους κατά 20%.

Ο επιστήμονας πρότεινε ότι υπάρχει ένας συγκεκριμένος μετρητής διαίρεσης στα κύτταρα, περιορίζοντας τον συνολικό αριθμό τους. 10 χρόνια αργότερα, ο Ρώσος επιστήμονας Alexei Olovnikov πρότεινε έναν υποθετικό μηχανισμό για τη λειτουργία αυτού του μετρητή.

Ο Olovnikov πρότεινε ότι κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, τα άκρα των χρωμοσωμάτων, που ονομάζονται τελομερή, κονταίνουν ελαφρώς. Και όταν τα τελομερή φτάσουν σε ένα κρίσιμο μήκος, το κύτταρο σταματά να διαιρείται και γερνά. Στη συνέχεια, η Elizabeth Helen Blackburn, Αμερικανίδα κυτταρογενετική επιστήμονας, κέρδισε το βραβείο βραβείο Νόμπελστη Φυσιολογία ή την Ιατρική το 2009, μαζί με τους Carol Greider και Jack Szostak, με τη διατύπωση «για την ανακάλυψη μηχανισμών για την προστασία των χρωμοσωμάτων από τα τελομερή και το ένζυμο τελομεράση» σύμφωνα με μια θεωρία που προτάθηκε το 1971 από τον Alexei Olovnikov.

Αντίθετα, σε μη γηρασμένα κύτταρα (για παράδειγμα, βλαστικά και εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα), πρέπει να υπάρχει ένα ένζυμο που επιμηκύνει τα τελομερή, επιτρέποντας στα κύτταρα να διαιρούνται σχεδόν απεριόριστα. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η βλάβη στο γονίδιο της τελομεράσης μειώνει σημαντικά τη ζωή των ζώων-μοντέλων και οδηγεί στην εμφάνιση του συνδρόμου της πρόωρης γήρανσης - προγηρίας.

Μετά την ανακάλυψη της τελομεράσης, δεκάδες επιστήμονες άρχισαν να προσπαθούν να φτιάξουν μια θεραπεία για τα γηρατειά με βάση αυτήν. Φαίνεται ότι η «ενεργοποίηση» της τελομεράσης σε όλα τα κύτταρα μπορεί να κάνει το σώμα αθάνατο. Ωστόσο, σύντομα προέκυψαν φόβοι λόγω του γεγονότος ότι η σύνθεση ενεργού τελομεράσης παρατηρείται στο 90% καρκινικούς όγκους. Προέκυψε το ερώτημα: η ενεργοποίηση της τελομεράσης θα οδηγούσε στον κίνδυνο κακοήθους μετασχηματισμού;

Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η γήρανση των κυττάρων δεν συνοδεύεται πάντα από μείωση των τελομερών. Για παράδειγμα, στην περίπτωση των επιθηλιακών κυττάρων του στοματικού βλεννογόνου ή του κερατοειδούς χιτώνα του ανθρώπινου ματιού. Αυτό υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση της τελομεράσης από μόνη της μπορεί να μην είναι αρκετή για να αναζωογονήσει ολόκληρο το σώμα. Πριν προχωρήσουμε στη γονιδιακή θεραπεία, οι επιδράσεις της τελομεράσης μελετήθηκαν σε διαγονιδιακά ποντίκια. Αποδείχθηκε ότι αν «ενεργοποιήσετε» το γονίδιο TERT σε όλα τα κύτταρα του ποντικιού, τότε το προσδόκιμο ζωής αυξάνεται κατά 40%! Ωστόσο, η συνεχής δραστηριότητα της τελομεράσης αύξησε επίσης τον κίνδυνο καρκίνου. Ως εκ τούτου, προέκυψε το ερώτημα πώς να ενεργοποιηθεί το έργο της τελομεράσης για μικρότερο χρονικό διάστημα.

Σήμερα, η τελομεράση μπορεί επίσης να διεγερθεί με φάρμακα. Μια ενδιαφέρουσα μελέτη σε αυτόν τον τομέα διεξήχθη από επιστήμονες από το Πανεπιστήμιο της Λιουμπλιάνας (Σλοβενία) το 2016 μετά από μια σειρά επιτυχημένων κλινικών δοκιμών για την αγγειακή αναζωογόνηση με χαμηλές δόσεις βαλσαρτάνης και φλουβαστατίνης. Αυτή τη φορά, μέτρησαν τη δραστηριότητα της τελομεράσης μετά από αγγειακή αναζωογόνηση σε δείγματα αίματος από 130 ασθενείς.

Έτσι, ένα μάθημα ενός μήνα αυξάνει σημαντικά τη δραστηριότητα της τελομεράσης κατά 3,28 φορές, γεγονός που συσχετίζεται σημαντικά με τη βελτίωση της ενδοθηλιακής λειτουργίας (αγγειακή αναζωογόνηση) και τη μείωση της φλεγμονής στα αιμοφόρα αγγεία. Και αυτό ανυψωμένο επίπεδοΗ τελομεράση επιμένει, σταδιακά μειώνεται, για άλλους έξι μήνες. Αλλά το πόσο αποτελεσματικά μια τέτοια αύξηση της τελομεράσης επηρεάζει τα τελομερή μένει να καθοριστεί.

Είναι σημαντικό να γνωρίζουμε ότι τα τελομερή δεν μπορούν απαραίτητα να παρατείνουν τη ζωή μας εάν μια τέτοια θεραπεία δεν γίνει την κατάλληλη στιγμή και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα.

Επιπλέον, η διέγερση της τελομεράσης από μόνη της μπορεί να μην επιμηκύνει τα τελομερή. Η δραστηριότητα της τελομεράσης σχεδόν δεν αλλάζει με την ηλικία - κοιτάξτε το γράφημα στα αριστερά. Και τα τελομερή εξακολουθούν να συρρικνώνονται.

Επίσης σήμερα υπάρχει ένα φάρμακο στην αγορά που αυξάνει τη δραστηριότητα της τελομεράσης - TA-65. Είναι πολύ ακριβό και η ζωή των ποντικών δεν επεκτάθηκε με κανέναν τρόπο στις μελέτες. Δείτε το γράφημα στα αριστερά εδώ. Σε μια μελέτη του 2011, επιστήμονες από την Εθνική Ισπανίας Κέντρο Καρκίνουάρχισαν να δίνουν σε μακρόβια ποντίκια δύο ετών TA-65 για να αυξήσουν την τελομεράση, όπως στην προηγούμενη μελέτη. Μόνο σε μια προηγούμενη μελέτη, τα ποντίκια έλαβαν ένεση για γονιδιακή θεραπεία. Αλλά το φάρμακο TA-65 δεν επέκτεινε τη ζωή των ποντικών με κανέναν τρόπο, σε αντίθεση με τη γονιδιακή θεραπεία (βλ. γράφημα στα αριστερά) και ήταν εντελώς άχρηστο για την παράταση της ζωής και την επιβράδυνση της γήρανσης.

Το 2011, επιστήμονες από το Πανεπιστήμιο του Τέξας μελέτησαν τελομερή και τελομεράση σε κυτταροκαλλιέργειες περισσότερων από 60 ειδών θηλαστικών. Ο ρόλος των τελομερών στη μακροζωία αποδείχθηκε ότι δεν ήταν τόσο προφανής... Μελέτες δείχνουν (όταν συγκρίνονται περίπου 60 είδη θηλαστικών), όσο μακρύτερα τελομερή σε ένα είδος, τόσο πιο γρήγορα συσσωρεύονται μεταλλάξεις DNA σε αυτό, περισσότεροι καρκινικοί όγκοι και μικρότερο προσδόκιμο ζωής . Το μήκος των τελομερών συσχετίζεται αντιστρόφως με τη διάρκεια ζωής. Αυτό υποδηλώνει ότι το αποτέλεσμα της παράτασης της ζωής της τελομεράσης, που ελήφθη σε ποντίκια με μία μόνο ένεση, μπορεί να μην παρατείνει τη ζωή των ανθρώπων. Το ζήτημα των τελομερών για τον άνθρωπο παραμένει ανοιχτό.

Συμπέρασμα:Στο μέλλον, θεωρητικά, με την εισαγωγή του γονιδίου τελομεράσης (TERT) στην ηλικία των 40-50 ετών, θα μπορούμε να αυξήσουμε το μήκος των τελομερών με μία μόνο ένεση, αλλά μια τέτοια θεραπεία από μόνη της σαφώς δεν αρκεί. Πιο γρήγορα, πρέπει να βρούμε έναν συνδυασμό αποτελεσμάτων γονιδιακής θεραπείας προκειμένου να παρατείνουμε σημαντικά τη ζωή του ανθρώπου. Σήμερα, μπορούμε να μιμούμε το αποτέλεσμα με έναν συνδυασμό φαρμάκων για ένα μήνα, έξι μήνες. βαλσαρτάνη 20 mg + φλουβαστατίνη 10-20 mg, ή τελμισαρτάνη + ατορβαστατίνη 10 mg.Τουλάχιστον αυτά τα φάρμακα σε συνδυασμό είναι ικανά να διεγείρουν την ίδια την τελομεράση.

Η διαταραχή του γονιδίου Agtr1a που κωδικοποιεί τους υποδοχείς AT1a της αγγειοτενσίνης παρατείνει τη ζωή των διαγονιδιακών ποντικών κατά 26% σε σύγκριση με τα ποντίκια άγριου τύπου.

Ο Kaplan, χρησιμοποιώντας το παράδειγμα των πρωτευόντων, έδειξε ότι αν συλλέξετε μια ομάδα αρσενικών πρωτευόντων, τότε μέσα σε λίγες μέρες οι πίθηκοι θα έχουν μια κοινωνική ιεραρχία. Η χειρότερη θέση σε μια τέτοια ιεραρχία είναι στον πάτο. Τα αρσενικά πρωτεύοντα σε υποδεέστερη θέση δείχνουν μια σειρά από δείκτες χρόνιου στρες. Συχνά αναπτύσσουν αθηροσκλήρωση. Όταν οι επιστήμονες έδωσαν στα αρσενικά πρωτεύοντα στο κατώτατο σημείο της κοινωνικής ιεραρχίας (σε κίνδυνο) έναν β-αναστολέα προπρανολόληκαταστέλλοντας τη δραστηριότητα του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, τότε η αγγειακή αθηροσκλήρωση δεν αναπτύχθηκε.

Αποδείχθηκε ότι το συμπαθητικό νευρικό σύστημα, λόγω του στρες, επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης και εμπλέκεται σε προβλήματα με την καρδιά και τα αιμοφόρα αγγεία. Το συναισθηματικό στρες εκδηλώνεται μέσω του συμπαθητικού (αδρενεργικού) αυτόνομου νευρικού συστήματος, το οποίο συνδέει τα κέντρα ελέγχου του εγκεφάλου μας και εσωτερικά όργανα. Συμπεριλαμβανομένων - με ανοσία, μυελός των οστώνΗ αθηροσκλήρωση είναι ο κύριος παράγοντας που οδηγεί στον μεγαλύτερο αριθμό θανάτων στις ανεπτυγμένες χώρες από καρδιακό έμφραγμα και εγκεφαλικό εγκεφαλικό επεισόδιο.

Μια τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο μελέτη του 1983 που οργανώθηκε από τον Goldstein S και τους συνεργάτες του έδειξε ότι η θεραπεία προπρανολόλησε 3837 ασθενείς με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, μειώνει τη θνησιμότητα από καρδιαγγειακά νοσήματα (η νούμερο 1 αιτία θανάτου στον κόσμο).

Τον Μάρτιο του 2017, Γάλλοι επιστήμονες ανέφεραν επιτυχημένες κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας για τη θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας.

Μια επιτροπή της Αμερικανικής Εθνικής Ακαδημίας Επιστημών και της Εθνικής Ακαδημίας Ιατρικής υποστήριξαν την επεξεργασία του γονιδιώματος των ανθρώπινων εμβρύων ήδη από το 2017. Αλλά μόνο για σοβαρές ασθένειεςκαι υπό αυστηρό έλεγχο.

συμπεράσματα

1. Όλες οι προσεγγίσεις στη γονιδιακή θεραπεία της γήρανσης χωρίζονται σε εκείνες όπου το γονίδιο της μακροζωίας παρέχεται στο σώμα και σε εκείνες όπου το γονίδιο ή η οδός γήρανσης είναι «απενεργοποιημένη».

2. Σε σύγκριση με άλλες προσεγγίσεις παράτασης ζωής, η γονιδιακή θεραπεία χρειάζεται να γίνεται μόνο μία φορά στη ζωή.

3. Εισαγωγή του γονιδίου της τελομεράσης (TERT), διαταραχή του γονιδίου Agtr1a, νοκ-άουτ GHRKO, διαταραχή στα γονίδια που κωδικοποιούν υποδοχείς IGF-1, υπερέκφραση FGF21, νοκ-άουτ AC5, διαγραφή RIP3, επεξεργασία γονιδίου PCSK9, υπερέκφραση Klotho Bunnock1, έκφραση, η υπερέκφραση MTH1 είναι όλα παραδείγματα από τα περισσότερα αποτελεσματικούς τρόπουςγενετική μηχανική ή γονιδιακή θεραπεία για την παράταση της ζωής των ζώων.

4. Για να επιτευχθούν πιο σημαντικά αποτελέσματα στη γονιδιακή θεραπεία της γήρανσης και στη γενετική μηχανική κατά της γήρανσης, είναι απαραίτητος ο συνδυασμός διαφορετικών προσεγγίσεων. Προσθέστε ετικέτες

Η γονιδιακή θεραπεία είναι η θεραπεία της κληρονομικής, μη κληρονομικής, η οποία πραγματοποιείται με την εισαγωγή άλλων γονιδίων στα κύτταρα του ασθενούς. Ο στόχος της θεραπείας είναι να εξαλείψει τα γονιδιακά ελαττώματα ή να δώσει στα κύτταρα νέες λειτουργίες. Είναι πολύ πιο εύκολο να εισαχθεί ένα υγιές, πλήρως λειτουργικό γονίδιο σε ένα κύτταρο παρά να διορθωθούν ελαττώματα σε ένα υπάρχον.

Η γονιδιακή θεραπεία περιορίζεται σε μελέτες σε σωματικούς ιστούς. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οποιαδήποτε παρέμβαση στο φύλο και στα γεννητικά κύτταρα μπορεί να δώσει ένα εντελώς απρόβλεπτο αποτέλεσμα.

Η τεχνική που χρησιμοποιείται σήμερα είναι αποτελεσματική στη θεραπεία τόσο μονογενών όσο και πολυπαραγοντικών ασθενειών (κακοήθεις όγκοι, ορισμένοι τύποι σοβαρών καρδιαγγειακών, ιογενών παθήσεων).

Περίπου το 80% όλων των έργων γονιδιακής θεραπείας σχετίζονται με τη μόλυνση από τον ιό HIV και επί του παρόντος ερευνώνται όπως η αιμορροφιλία Β, η κυστική ίνωση, η υπερχοληστερολαιμία.

Η θεραπεία περιλαμβάνει:

απομόνωση και διάδοση μεμονωμένων τύπων κυττάρων ασθενών.

εισαγωγή ξένων γονιδίων.

επιλογή κυττάρων στα οποία το ξένο γονίδιο έχει «ριζώσει»·

Η εμφύτευσή τους στον ασθενή (για παράδειγμα, μέσω μετάγγισης αίματος).

Η γονιδιακή θεραπεία βασίζεται στην εισαγωγή κλωνοποιημένου DNA στους ιστούς του ασθενούς. κατά το μέγιστο αποτελεσματικές μεθόδουςΑυτό περιλαμβάνει ενέσιμα εμβόλια και εμβόλια αεροζόλ.

Η γονιδιακή θεραπεία λειτουργεί με δύο τρόπους:

1. Θεραπεία μονογονιδιακών νοσημάτων. Αυτές περιλαμβάνουν διαταραχές στον εγκέφαλο, οι οποίες σχετίζονται με οποιαδήποτε βλάβη στα κύτταρα που παράγουν νευροδιαβιβαστές.

2. Θεραπεία Οι κύριες προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται σε αυτόν τον τομέα είναι:

γενετική βελτίωση κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος;

αύξηση της ανοσοαντιδραστικότητας του όγκου.

μπλοκ έκφρασης ογκογονιδίου;

προστασία των υγιών κυττάρων από τη χημειοθεραπεία.

εισαγωγή ογκοκατασταλτικών γονιδίων.

παραγωγή αντικαρκινικών ουσιών από υγιή κύτταρα.

παραγωγή αντικαρκινικών εμβολίων·

τοπική αναπαραγωγή φυσιολογικών ιστών με τη βοήθεια αντιοξειδωτικών.

Η χρήση της γονιδιακής θεραπείας έχει πολλά πλεονεκτήματα και σε ορισμένες περιπτώσεις είναι η μόνη ευκαιρία για κανονική ζωήγια άρρωστους. Ωστόσο, αυτός ο τομέας της επιστήμης δεν έχει διερευνηθεί πλήρως. Υπάρχει διεθνής απαγόρευση των δοκιμών σε φύλο και προεμφυτευτικά γεννητικά κύτταρα. Αυτό γίνεται για να αποτραπούν ανεπιθύμητα γονιδιακά κατασκευάσματα και μεταλλάξεις.

Ορισμένες συνθήκες υπό τις οποίες επιτρέπονται οι κλινικές δοκιμές έχουν αναπτυχθεί και είναι γενικά αναγνωρισμένες:

Το γονίδιο που μεταφέρεται στα κύτταρα στόχους πρέπει να είναι ενεργό για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Σε ένα ξένο περιβάλλον, το γονίδιο πρέπει να διατηρήσει την αποτελεσματικότητά του.

Η μεταφορά γονιδίων δεν πρέπει να προκαλεί αρνητικές αντιδράσεις στο σώμα.

Υπάρχουν ορισμένα ερωτήματα που παραμένουν επίκαιρα σήμερα για πολλούς επιστήμονες σε όλο τον κόσμο:

Θα μπορέσουν οι επιστήμονες που εργάζονται στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας να αναπτύξουν μια πλήρη γονιδιακή διόρθωση που δεν θα αποτελεί απειλή για τους απογόνους;

Η ανάγκη και το όφελος μιας διαδικασίας γονιδιακής θεραπείας για ένα μεμονωμένο ζευγάρι θα αντισταθμίσει τον κίνδυνο αυτής της παρέμβασης για το μέλλον της ανθρωπότητας;

Δικαιολογούνται παρόμοιες διαδικασίες, δεδομένου του μέλλοντος;

Πώς θα συσχετιστούν τέτοιες διαδικασίες στους ανθρώπους με τα ζητήματα της ομοιόστασης της βιόσφαιρας και της κοινωνίας;

Συμπερασματικά, μπορεί να σημειωθεί ότι η γενετική θεραπεία στο παρόν στάδιο προσφέρει στην ανθρωπότητα τρόπους να θεραπεύσει περισσότερο σοβαρές ασθένειες, που μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ανίατες και μοιραίες. Ωστόσο, ταυτόχρονα, η ανάπτυξη αυτής της επιστήμης θέτει νέα προβλήματα στους επιστήμονες που πρέπει να αντιμετωπιστούν σήμερα.