Gen tedavisinde genetik transfeksiyon yöntemleri. Moleküler Terapinin Temelleri

Sağlık

Arızalı genleri sağlıklı olanlarla değiştirme kavramı, geçen yüzyılın doksanlı yıllarının başlarında aktif olarak bilimsel bir kabuk edinmeye başlayan en umutsuz hastalara umut veriyor gibiydi. Bununla birlikte, 1990'da gerçekleştirilen gen tedavisi üzerine ilk deneyden bu yana, bilim adamları arasındaki iyimserlik biraz azaldı - ve hepsi de gen tedavisi yöntemlerinin uygulanmasındaki belirli başarısızlıklar ve zorluklar nedeniyle. Bununla birlikte, gen tedavisinin Parkinson hastalığı, kistik fibroz tedavisi için sunduğu olanaklar, Çeşitli türler kanser ve diğer birçok hastalık gerçekten sınırsızdır. Bilim adamlarının yorulmadan çalışmasının nedeni budur. gen tedavisi ile ilgili yollarında ortaya çıkan tüm zorlukların üstesinden gelmeye çalışıyorlar.

Gen tedavisi nedir?

Peki gen tedavisi tam olarak nedir? Bu soruya cevap verebilmek için şunu hatırlatmak gerekir. Vücudumuzdaki genlerin temel işlevi protein üretimini düzenlemektir. tüm hücrelerin normal işleyişi ve sağlığı için gereklidir. Ancak bazı genetik kusurlar (genlerdeki kusurlar), ana işlevlerine bir dereceye kadar müdahale ederek protein üretimini engeller. Gen tedavisinin (gen tedavisi) amacı, kusurlu genleri sağlıklı olanlarla değiştirmek. Bu, karşılık gelen proteinin çoğaltılmasına yardımcı olacaktır, bu da bir kişinin belirli bir hastalıktan kurtulacağı anlamına gelir.

İdeal gelişim senaryosu göz önüne alındığında, hücreler ayarlanmış deoksiribonükleik asit (DNA) molekülleri vücudun genetik anomaliden kurtulmasını ve tamamen iyileşmesini sağlayacak düzeltilmiş genin çoklu kopyalarını üretmeye, bölmeye başlayacak. Bununla birlikte, sağlıklı genlerin hastalıklı hücrelere dahil edilmesi (ve buna karşılık gelen sapmaları düzeltme girişimleri) son derece karmaşık bir süreçtir. ki şimdiye kadar nadiren başarılı olmuştur.. Bu nedenle çoğu modern araştırma, genleri hasarlı hücrelere sokmak için güvenli ve güvenilir mekanizmalar geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Gen tedavisi türleri: ex vivo ve in vivo tedavi

DNA'nın hastanın genomuna dahil edilme yöntemine bağlı olarak gen tedavisi gerçekleştirilebilir. ya hücre kültüründe (ex vivo) ya da doğrudan vücutta (in vivo). Ex vivo gen terapisi durumunda, hücreler hastanın vücudundan çıkarılır, genetiği değiştirilir ve daha sonra kişinin vücuduna yeniden verilir. Bu yöntem özellikle kan hastalıklarının tedavisinde faydalıdır, çünkü kan hücreleri oldukça kolay bir şekilde çıkarılıp yerine konabilir. Bununla birlikte, diğer hastalıkların çoğunda, hücreleri vücuttan çıkarmak ve tekrar yerine koymak kolay değildir. Örneğin, genetik nedenlere bağlı kalp hastalığı durumunda, etkili bir önlem, gen değişiklikleri doğrudan hastanın vücudunda gerçekleştirildiğinde, sözde in vivo gen tedavisidir. Bu işlemin yapılabilmesi için genetik bilgi bir vektör - bir nükleik asit molekülü vasıtasıyla doğrudan hücreye iletilir, genetik mühendisliğinde genetik materyali aktarmak için kullanılır. Çoğu durumda, bu aktarımı gerçekleştirmek için araştırmacılar, sağlığa ve hayata zararlı olmayan virüsleri kullanırlar.

Hücreye genetik bilgi verme yöntemleri

Çok sayıda çalışma, çeşitli virüslerin kullanımının çok etkili bir çözüm olduğunu göstermektedir, Bu, vücudun bağışıklık savunmasını geçmenizi sağlar ve daha sonra virüsü yaymak için kullanarak hücreleri enfekte eder. Bu prosedürü gerçekleştirmek için genetik mühendisleri, retrovirüsler ve adenovirüsler grubundan en uygun virüsleri seçtiler. Retrovirüsler, DNA'da depolanan genetik bilginin işlenmesine yardımcı olan DNA benzeri bir molekül olan ribonükleik asit (RNA) biçiminde genetik bilgi getirir. Sözde hedef hücreye derinlemesine nüfuz etmek mümkün olur olmaz, RNA molekülünden DNA molekülünün bir kopyası elde edilir. Bu işleme ters transkripsiyon denir. Bir hücreye yeni bir DNA molekülü eklendiğinde, hücrenin tüm yeni kopyaları bu değiştirilmiş geni içerecektir.

Adenovirüsler, bölünmeyen bir hücreye iletilen DNA biçiminde hemen genetik bilgiyi taşır. Rağmen bu virüsler DNA'yı doğrudan hedef hücrenin çekirdeğine iletir. DNA, hücrenin genomuna uymaz. Böylece modifiye edilmiş gen ve genetik bilgi yavru hücrelere aktarılmaz. Adenovirüsler kullanılarak gerçekleştirilen gen tedavisinin avantajı, genleri sinir sistemi hücrelerine ve mukoza zarına sokmanın mümkün olmasıdır. solunum sistemi, yine bir vektör aracılığıyla. Ek olarak, sözde adeno-ilişkili virüsler aracılığıyla gerçekleştirilen üçüncü bir gen tedavisi yöntemi vardır. Bu virüsler içerir nispeten az miktarda genetik bilgi ve ortadan kaldırılması retrovirüsler ve adenovirüslerden çok daha zordur. Bununla birlikte, adeno-ilişkili virüslerin avantajı, reaksiyona neden olmamalarıdır. bağışıklık sistemi kişi.

Gen tedavisinde virüs kullanımındaki zorluklar

Genetik bilginin virüsler aracılığıyla hücreye iletilme yöntemiyle ilgili temel sorun şudur: genlerin bir hedef hücre ile bağlantısını tamamen kontrol etmek son derece zordur.. Sağlıklı hücreleri kanser hücrelerine dönüştürebilen sözde gen ekspresyonu göz ardı edilmediğinden, bu son derece tehlikeli olabilir. Zamanın bu noktasında, bu sorun özellikle retrovirüslerle uğraşırken önemlidir. ikinci sorun çözümü henüz organize edilemeyen, gen tedavisinin kullanımı için bir prosedürün çoğu zaman yeterli olmadığı gerçeğinde yatmaktadır. Çoğu genetik tedavinin zaman zaman tekrarlanması gerekir. Üçüncüsü, bir hücreye genetik bilgi iletmek için virüslerin kullanılması, vücudun bağışıklık sisteminin reaksiyona girme riski nedeniyle karmaşıktır. Bu aynı zamanda, özellikle aşağıdaki durumlarda son derece ciddi bir sorundur: gen tedavisi prosedürünün tekrar tekrar tekrarlanması gerektiğinde, hastanın vücudu yavaş yavaş uyum sağladıkça ve enjekte edilen virüslerle daha etkili bir şekilde savaşmaya başlar.

Gen Tedavisi: Araştırma Devam Ediyor

Başarı hakkında konuşursak, o zaman bu noktada genetik terapi son derece etkili bir önlemdir. sözde kombine immün yetmezlik tedavisinde, X kromozomu genine bağlı. Öte yandan, bu hastalığın tedavisi için gen tedavisinin başarılı bir şekilde kullanıldığı çok az vaka vardır. Ayrıca, lösemili kişilerde bulunan hastalarda bir takım semptomlara neden olabileceğinden, tedavinin kendisi riskli bir girişimdir. Bu hastalık dışında, gen tedavisinin bu kadar etkili olduğu çok, çok az vaka vardır. son çalışmalar gen tedavisinin erken kullanımı için umut veriyor olsa da artrit, beyin kanseri, orak hücreli anemi, retina yarığı ve diğer bazı durumlardan muzdarip hastaların tedavisi için.

Gen tedavisinin tıpta pratik uygulaması hakkında konuşmak için henüz çok erken olduğu ortaya çıktı. Yine de, araştırmacılar gen tedavisini güvenli ve etkili bir şekilde kullanmanın yollarını aramaya devam ediyor, deneylerin çoğunu vücuttan yapay bir dış ortama aktarılan canlı dokuda gerçekleştirdi. Bu deneyler arasında, bilim insanlarının 47. kromozomlu yapay bir kromozomu hedef hücreye sokmaya çalıştıkları çalışmalar son derece ilgi çekicidir. Son bilimsel bulgular, bilim insanlarının süreçleri daha iyi anlamasını sağlamıştır. Bir RNA molekülünün girişi sırasında meydana gelen. Bu, Hamilton hastalığının tedavisinde faydalı olabilecek gen transkripsiyonunu (gen nakavt olarak adlandırılan) baskılamak için bir mekanizmanın geliştirilmesine yol açmıştır. Bilim adamları ayrıca, daha önce bir vektör kullanılarak yapılamayan, genetik bilgiyi beyin hücrelerine iletmenin bir yolunu geliştirmeyi başardıklarını bildirdiler. bu molekül bu amaç için çok büyük olduğundan. Başka bir deyişle, araştırmalar devam ediyor, bu da insanlığın, gen tedavisi yöntemlerini kullanarak hastalıklarla nasıl savaşılacağını öğrenmek için her şansı olduğu anlamına geliyor.

14943 0

Mutasyonları belirli hastalıklara neden olan bir genin yeri ve dizisinin yanı sıra mutasyonun kendisinin ve modern yollar testi, hastalığın organizmanın neo- ve hatta doğum öncesi gelişim döneminde teşhis edilmesini mümkün kılar. Bu, ilaç tedavisi, diyet, kan nakli vb. yardımıyla genetik bir kusurun tezahürünü hafifletmeyi mümkün kılar.

Bununla birlikte, bu yaklaşım, kusurun kendisinin düzeltilmesine yol açmaz ve kural olarak kalıtsal hastalıklar tedavi edilemez. Durum, bir genin mutasyonunun vücut üzerinde çeşitli sonuçları olabileceği gerçeğiyle daha da karmaşıklaşıyor. Bir gen mutasyonu, kodladığı enzimin aktivitesinde değişikliklere neden olursa, bu, toksik bir substratın birikmesine veya tersine, hücrenin normal çalışması için gerekli bir bileşiğin eksikliğine yol açabilir.

Böyle bir hastalığın iyi bilinen bir örneği fenilketonüridir. Fenilalanin'in tirozine dönüşümünü katalize eden karaciğer enzimi fenilalanin dehidroksilaz için gendeki bir mutasyondan kaynaklanır. Sonuç olarak, kandaki endojen fenilalanin seviyesi artar, bu da aksonların etrafında miyelin kılıfının uygunsuz oluşumuna neden olur. sinir hücreleri merkezi sinir sistemi ve bunun sonucunda ciddi zeka geriliği.

Mutasyon yapısal protein genini etkilerse, bu durum hücre, doku veya organ düzeyinde ciddi bozukluklara yol açabilir. Böyle bir hastalığın bir örneği kistik fibrozdur.

Kistik fibroz taşıyıcısı adı verilen bir proteini kodlayan gendeki bir delesyon, kusurlu bir proteinin sentezine (fenilalanin 508'in yokluğu) ve klorür iyonlarının hücre zarlarından geçişinin bozulmasına yol açar. Bunun en zararlı etkilerinden biri, akciğerleri kaplayan ve koruyan mukusun anormal derecede kalınlaşmasıdır. Bu, akciğer hücrelerine erişimi zorlaştırır ve zararlı mikroorganizmaların birikmesine katkıda bulunur. Akciğerlerin hava yollarını kaplayan hücreler ölür ve yerini fibröz yara dokusu alır (hastalığın adı buradan gelir). Sonuç olarak, hasta solunum yetmezliğinden ölür.

Kalıtsal hastalıklar karmaşıktır klinik bulgular ve geleneksel tedavileri esas olarak semptomatiktir: fenilketonüri tedavisi için alanin içermeyen bir diyet reçete edilir, kusurlu proteinler fonksiyonel olanlarla değiştirilir. intravenöz uygulama, kaybedilen fonksiyonların telafisi için kemik iliği veya diğer organlar nakledilir. Kural olarak, tüm bu önlemler etkisiz, pahalı, uzun vadeli ve sadece birkaç hasta yaşlılığa kadar yaşıyor. Bu nedenle, temelde yeni terapi türlerinin geliştirilmesi çok önemlidir.

Gen tedavisi

1990'da ABD'de Dr. W. French Andrson, Ashanti de Silva adlı üç yaşındaki bir kız çocuğunda şiddetli kombine immün yetmezliğin (SCID) tedavisi için gen tedavisine yönelik ilk girişimi yaptı. Bu hastalığa adenosanadenilaz (ADA) kodlayan gendeki bir mutasyon neden olur. Bu enzimin eksikliği kanda adenozin ve deoksiadenozin birikimine katkıda bulunur, toksik etki B ve T lenfositlerin ölümüne yol açan Periferik kan ve sonuç olarak immün yetmezlik.

Böyle bir hastalığı olan çocuklar herhangi bir enfeksiyondan korunmalıdır (özel steril hücrelerde saklayın), çünkü herhangi bir hastalık ölümcül olabilir. Tedavinin başlamasından 4 yıl sonra, çocuk, steril odayı terk etmesine ve normal bir yaşam sürmesine izin veren, normal olarak işleyen bir ADA ve SCID semptomlarının hafiflemesi ifadesini gösterdi.

Böylece, somatik hücrelerin başarılı genetik tedavisinin temel olasılığı gösterildi. 90'lardan beri. Hemofili, AIDS gibi ciddi hastalıklar da dahil olmak üzere bir dizi genetik hastalık için gen tedavisi denemelerinden geçiyorlar farklı şekiller malign neoplazmalar, kistik fibroz, vb. Şu anda, transgenez yardımı ile yaklaşık 10 insan hastalığı tedavi edilebilir.

Genetik hastalıkların çeşitliliği, gen tedavisine yönelik birçok yaklaşımın gelişimini önceden belirlemiştir. Bu durumda, 2 ana problem çözülmüştür: terapötik bir genin iletilmesinin bir yolu; düzeltme amaçlı hücrelere hedefli teslimat sağlamak için bir yöntem. Bugüne kadar, somatik hücrelerin gen tedavisine yönelik tüm yaklaşımlar iki kategoriye ayrılabilir: ex vivo ve in vivo tedavi (Şekil 3.15).

Pirinç. 3.15. Ex vivo (a) ve in vivo (a) gen terapisi şeması

İn vivo gen terapisi, terapötik bir genin doğrudan belirli bir hasta dokusunun hücrelerine verilmesini içerir. Bu yaklaşımları daha ayrıntılı olarak ele alalım.

Ex vivo gen terapisi aşağıdaki adımları içerir:
1) hastanın kusurlu hücrelerinin elde edilmesi ve bunların ekimi;
2) bir terapötik gen yapısının transfeksiyonu ile istenen genin izole edilmiş hücrelere transferi;
3) genetik olarak düzeltilmiş hücrelerin seçimi ve büyümesi;
4) bu hücrelerin hastaya transplantasyonu veya transfüzyonu.

Hastanın kendi hücrelerinin kullanılması, bir kez geri döndüklerinde hastanın bir bağışıklık tepkisi geliştirmemesini sağlar. Gen yapısı transfer prosedürü verimli olmalı ve normal gen stabil bir şekilde muhafaza edilmeli ve sürekli olarak ifade edilmelidir.

Doğanın kendi yarattığı genleri aktarma araçları virüslerdir. Gen aktarımı için etkili vektörler elde etmek amacıyla, esas olarak iki grup virüs kullanılır - adenovirüsler ve retrovirüsler (Şekil 3.16). Gen terapisinde, genetik olarak nötralize edilmiş virüslerin varyantları kullanılır.

Pirinç. 3.16. Terapötik vektörler oluşturmak için kullanılan virüsler

Pirinç. 3.17. Tipik bir retrovirüsün (a) genetik haritası ve retroviral vektör haritasının (a)

Bir retroviral vektörün alınması üzerine, retrovirüsün tam uzunluktaki DNA'sı plazmide eklenir, gag geninin çoğu çıkarılır ve pol ve env genleri tamamen çıkarılır ve bunların yerine "terapötik" T geni ve gerekirse, kendi promotörü ile seçici seçici Rg geni eklenir (Şekil 3.17, b). T geninin transkripsiyonu, 5'-LTR bölgesinde lokalize olan aynı güçlü promotör tarafından kontrol edilecektir Bu şemaya dayalı olarak, çeşitli retroviral vektörler ve yaklaşık 8 kb'lik maksimum DNA ek boyutu yaratılmıştır.

Bu şekilde elde edilen yapı, transformasyon için kendi başına kullanılabilir, ancak verimliliği ve ardından konakçı hücre genomuna entegrasyonu son derece düşüktür. Bu nedenle, tam uzunluktaki retroviral vektör RNA'yı bozulmamış viral partiküller halinde paketlemek için bir teknik geliştirilmiştir. yüksek frekans hücreye nüfuz eder ve konak genomuna entegre edilmeleri garanti edilir. Bunun için sözde "paketleme" hücre hattı oluşturuldu. Bu hücrelerin kromozomlarının iki farklı bölümünde + (84*+) dizisinin olmaması nedeniyle topaklanma yeteneğinden yoksun bırakılan retroviral genler gag ve pol-env dikilir (Şekil 3.18).

Pirinç. 3.18. Paketlenmiş bir viral vektör elde etme şeması

Retrovirüsler aktif olarak sadece hızla bölünen hücreleri enfekte eder. Gen transferi için, saflaştırılmış paketlenmiş retroviral vektör partikülleri ile işlenirler veya onları üreten bir hücre hattı ile birlikte kültürlenirler ve daha sonra hedef ve paketleme hücrelerini ayırmak için seçilirler.

Dönüştürülen hücreler, terapötik gen ürününün sentez seviyesi, replikasyon yetkin retrovirüslerin yokluğu, hücrelerin büyüme veya işlev görme yeteneğindeki değişikliklerin yokluğu için dikkatlice kontrol edilir.

Gen tedavisi için en uygun olanı kemik iliği hücreleridir. Bunun nedeni, içinde çoğalabilen ve farklılaşabilen totipotent embriyonik kök hücrelerin varlığıdır. farklı şekiller hücreler -B- ve T-lenfositler, makrofajlar, eritrositler, trombositler ve osteoklastlar. Bu hücreler, aralarında daha önce bahsedilen ciddi kombine immün yetmezlik, Gaucher hastalığı, orak hücreli anemi, talasemi, osteoporoz vb. Gibi bir dizi kalıtsal hastalığı tedavi etmek için kullanılır.

İzole edilmesi ve kültürü zor olan totipotent kemik iliği kök hücrelerine ek olarak, hiperkolesterolemi tedavisi için kordon kanı kök hücreleri (yenidoğan gen tedavisi için tercih edilen kullanım) ve karaciğer hücreleri - hepatositler - kullanılır.

İn vivo gen terapisinde, terapötik genin kusurlu hücrelere verilmesini sağlamak özellikle önemlidir. Bu tür hedeflenmiş teslimat, belirli hücre tiplerini enfekte edebilen virüslere dayalı olarak modifiye edilmiş vektörler tarafından sağlanabilir. Yukarıda bahsedilen kistik fibroz tedavisi için geliştirilen yaklaşımı düşünün. Akciğerler açık bir boşluk olduğundan, onlara terapötik genleri vermek nispeten kolaydır. Sağlıklı genin klonlanmış bir varyantı, inaktive edilmiş bir adenovirüse dahil edildi (Şekil 3.19). Bu tür virüsün özelliği, akciğerlerin astarını enfekte etmesi ve soğuk algınlığına neden olmasıdır.

Pirinç. 3.19. Adenovirüse dayalı bir vektör elde etme şeması

Retro ve adenovirüslere ek olarak, Herpes simpleks virüsü gibi diğer virüs türleri de gen terapisi deneylerinde kullanılır. Bu çift sarmallı (152 kb) DNA virüsünün bir özelliği, nöronları spesifik olarak enfekte etme yeteneğidir. Merkezi ve periferik organları etkileyen bilinen birçok genetik hastalık vardır. gergin sistem- tümörler, metabolik bozukluklar, nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı).

Virüs herpes simpleks Tip I (HSV), bu tür hastalıkların tedavisi için çok uygun bir vektördür. Bu virüsün kapsidi nöronun zarı ile birleşir ve DNA'sı çekirdeğe taşınır. HSV vektörleri kullanılarak terapötik bir genin aktarılması için çeşitli yöntemler önerilmiş ve deney hayvanları üzerinde başarılı testler gerçekleştirilmiştir.

Viral vektörlerin birkaç dezavantajı vardır: yüksek maliyet, sınırlı klonlama kapasitesi ve olası Tahrik edici cevap. Böylece, 1999'da, bir adenoviral vektörün girişine karşı alışılmadık derecede güçlü bir bağışıklık tepkisinin bir sonucu olarak, ilaç denemelerine katılan 18 yaşındaki bir gönüllü öldü. 2002'de Fransa'da iki çocuk, immün yetmezlik tedavisi sırasında (retrovirüsler kullanarak terapötik genleri kök hücrelere sokarak) lösemi benzeri bir durum geliştirdi.

Bu nedenle viral olmayan gen dağıtım sistemleri geliştirilmektedir. En basit ve en verimsiz yol, plazmit DNA'yı dokulara enjekte etmektir. İkinci yaklaşım, dokuların DNA ile konjuge edilmiş altın mikropartiküller (1-3 µm) ile bombardıman edilmesidir. Bu durumda, terapötik genler hedef dokularda ifade edilir ve ürünleri - terapötik proteinler - kan dolaşımına girer. Bu yaklaşımın ana dezavantajı, bu proteinlerin kan bileşenleri tarafından erken etkisiz hale getirilmesi veya yok edilmesidir.

DNA, yapay bir lipid kabuk içinde paketlenerek teslim edilebilir. Bu şekilde elde edilen küresel partiküller-lipozomlar hücre zarına kolayca nüfuz eder. Çeşitli özelliklere sahip lipozomlar oluşturulmuştur, ancak şimdiye kadar bu tür teslimatın verimliliği düşüktür, çünkü çoğu DNA lizozomal degradasyona uğrar. Ayrıca, bir genetik yapı sağlamak için DNA konjugatları, güvenliğini, hedeflenen teslimatı ve hücre penetrasyonunu sağlayabilen çeşitli moleküllerle sentezlenir.

Son yıllarda, bir veya daha fazla terapötik gen için eksiksiz bir düzenleyici element seti ile büyük miktarda genetik materyalin dahil edilmesini sağlayacak yapay bir 47. kromozom oluşturmak için yoğun deneyler yapılmıştır. Bu, terapötik genin genomik bir varyantının kullanılmasını mümkün kılacaktır ve böylece onun stabilitesini ve verimli uzun vadeli ekspresyonunu temin edecektir. Yapılan deneyler, terapötik genler içeren yapay bir insan kromozomunun oluşturulmasının oldukça gerçekçi olduğunu göstermiştir, ancak bu kadar büyük bir molekülün hedef hücrenin çekirdeğine nasıl yerleştirileceği henüz netlik kazanmamıştır.

Gen tedavisinin karşılaştığı ana problemler, şiddetli bir bağışıklık reaksiyonu riskine ek olarak, terapötik DNA'nın hastanın vücudunda uzun süreli depolanması ve işleyişinin zorlukları, birçok hastalığın multigenitesi, bu da onları gen için zor bir hedef haline getirir. tedavi ve vektör olarak virüs kullanma riski.

ÜZERİNDE. Voinov, T.G. Volova

Tanıtım

Her yıl bilimsel dergilerde, tıbbi klinik çalışmalar hakkında, şu ya da bu şekilde, çeşitli genlerin tanıtılmasına dayanan bir tedavinin kullanıldığı - gen tedavisi - giderek daha fazla makale ortaya çıkıyor. Bu yön, moleküler genetik ve biyoteknoloji gibi iyi gelişmiş biyoloji dallarından büyümüştür.

Çoğu zaman, geleneksel (muhafazakar) yöntemler zaten denendiğinde, hastaların hayatta kalmasına ve hatta tamamen iyileşmesine yardımcı olabilecek gen tedavisidir. Örneğin, bu kalıtsal monogenik hastalıklar, yani tek bir gendeki bir kusurun neden olduğu hastalıklar ve diğerleri için geçerlidir. Veya örneğin, damar lümeninde daralma olan hastalar için gen tedavisi bir uzvunu kurtarabilir ve kurtarabilir. alt uzuvlar ve sonuç olarak, çevre dokularda kalıcı iskemi gelişmiştir, yani bu dokular ciddi şekilde yetersizdir. besinler ve normalde kan tarafından vücutta taşınan oksijen. Bu tür hastaları cerrahi müdahaleler ve ilaçlarla tedavi etmek genellikle imkansızdır, ancak hücreler yerel olarak yeni damarların oluşum ve çimlenme sürecini etkileyecek daha fazla protein faktörü atmaya zorlanırsa, iskemi çok daha az belirgin hale gelir ve daha az belirgin hale gelir. hastaların yaşaması çok daha kolay.

gen tedavisi günümüzde gen kusurlarını hedef almak veya hücrelere yeni işlevler kazandırmak amacıyla hastaların hücrelerine genler sokarak hastalıkların tedavisi olarak tanımlanabilir. 22 Mayıs 1989'da kanseri teşhis etmek için gen tedavisi yöntemlerinin ilk klinik denemeleri yapıldı. Öncelikle kalıtsal hastalık, hangi gen tedavisi yöntemlerinin uygulandığı konusunda kalıtsal immün yetmezlik olduğu ortaya çıktı.

Her yıl başarıyla yürütülen klinik tedavi denemelerinin sayısı çeşitli hastalıklar gen tedavisinin kullanımı ile büyüyor ve Ocak 2014 itibariyle 2 bine ulaştı.

Aynı zamanda, gen tedavisi üzerine modern araştırmalarda, genleri manipüle etmenin veya "karıştırılmış" (rekombinant) DNA'nın sonuçlarının dikkate alınması gerekir. canlıda(lat. kelimenin tam anlamıyla "canlı") yeterince çalışılmamıştır. Bu alanda araştırmaların en ileri düzeyde olduğu ülkelerde, özellikle Amerika Birleşik Devletlerinde, duyu DNA dizilerinin kullanıldığı tıbbi protokoller, ilgili komite ve komisyonlarda zorunlu incelemeye tabi tutulmaktadır. ABD'de bunlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri (Ulusal Sağlık Enstitüleri) direktörü tarafından projenin zorunlu olarak onaylanması ile Rekombinant DNA Danışma Komitesi (RAC) ve Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)'dir.

Bu nedenle, bu tedavinin, vücudun bazı dokularında bazı bireysel protein faktörlerinden yoksun olması durumunda, bu dokulara uygun protein kodlayan genlerin eklenmesiyle bunun düzeltilebileceği ve her şeyin az ya da çok harika olacağı gerçeğine dayandığına karar verdik. . Proteinlerin kendilerini tanıtmaları mümkün olmayacaktır çünkü vücudumuz hemen tepki verecektir. bağışıklık tepkisi ve eylemin süresi yetersiz olacaktır. Şimdi geni hücrelere verme yöntemine karar vermemiz gerekiyor.

transfeksiyon hücreler

Başlangıç ​​olarak, bazı terimlerin tanımlarını vermeye değer.

Gen taşınması şu şekilde gerçekleştirilir: vektör olarak kullanılan bir DNA molekülüdür. araç» genetik bilginin hücreye yapay olarak aktarılması için. Birçok vektör türü vardır: plazmit, viral, ayrıca kozmidler, fazmitler, yapay kromozomlar vb. Vektörlerin (özellikle plazmit vektörlerin) kendi karakteristik özelliklerine sahip olması çok önemlidir:

1. Çoğaltmanın kökeni (ori)- DNA duplikasyonunun başladığı nükleotid dizisi. Vektör DNA kopyalayamazsa (kopyalayamazsa), o zaman gerekli iyileştirici etki başarılamayacak, çünkü hücre içi nükleaz enzimleri tarafından hızla parçalanacak ve şablonların olmaması nedeniyle, sonunda çok daha az protein molekülü oluşacaktır. Bu noktaların her biyolojik tür için özel olduğu, yani vektör DNA'nın bir bakteri kültüründe çoğaltılmasıyla elde edilmesi gerekiyorsa (ve sadece değil) not edilmelidir. kimyasal sentez genellikle çok daha pahalıdır), o zaman iki ayrı replikasyon kaynağı gerekli olacaktır - insanlar ve bakteriler için;

2. kısıtlama siteleri- özel enzimler (kısıtlama endonükleazları) tarafından tanınan ve onlar tarafından belirli bir şekilde kesilen spesifik kısa diziler (genellikle palindromik) - "yapışkan uçlar" oluşumu ile (Şekil 1).

Şekil.1 Kısıtlayıcıların katılımıyla "yapışkan uçlar" oluşumu

Bu siteler, vektör DNA'sını (aslında bir "boş" olan) istenen terapötik genlerle tek bir molekül halinde çapraz bağlamak için gereklidir. İki veya daha fazla parçadan çapraz bağlanan böyle bir moleküle "rekombinant" denir;

3. Rekombinant DNA molekülünün milyonlarca kopyasını elde etmek istediğimiz açıktır. Yine, bir bakteri hücresi kültürüyle uğraşıyorsak, o zaman bu DNA'nın daha fazla izole edilmesi gerekir. Sorun şu ki, tüm bakteriler ihtiyacımız olan molekülü yutmayacak, bazıları da yutamayacak. Bu iki grubu ayırt etmek için vektör DNA'sına yerleştirilirler. seçici belirteçler- belirli direnç bölgeleri kimyasallar; şimdi, aynı maddeler çevreye eklenirse, sadece onlara dirençli olanlar hayatta kalacak ve diğerleri ölecek.

Tüm bu üç bileşen, yapay olarak sentezlenen ilk plazmitte gözlemlenebilir (Şekil 2).

İncir. 2

Belirli hücrelere bir plazmit vektörü sokma işlemine denir. transfeksiyon. Plazmit, bir bakteri hücresinin sitoplazmasında bulunan oldukça kısa ve genellikle dairesel bir DNA molekülüdür. Plazmitler bakteri kromozomu ile ilişkili değildir, ondan bağımsız olarak çoğalabilirler, bakteri tarafından hücre içine atılabilirler. Çevre veya tersine, emilir (emilim süreci - dönüşüm). Plazmitlerin yardımıyla bakteriler genetik bilgi alışverişinde bulunabilirler, örneğin belirli antibiyotiklere direnç transferi yapabilirler.

Plazmitler in vivo bakterilerde bulunur. Ancak hiç kimse, bir araştırmacının ihtiyaç duyduğu özelliklere sahip bir plazmiti yapay olarak sentezlemesine, içine bir ekleme geni dikmesine ve bir hücreye sokmasına engel olamaz. Aynı plazmide farklı ekler yerleştirilebilir .

Gen tedavisi yöntemleri

Hedef hücrelerin doğasında farklılık gösteren iki ana yaklaşım vardır:

1. Yabancı DNA'nın zigota (döllenmiş yumurta) veya embriyoya dahil edildiği fetal erken aşama gelişim; bu durumda tanıtılan materyalin alıcının tüm hücrelerine (ve hatta germ hücrelerine) girmesi ve böylece bir sonraki nesle aktarımın sağlanması beklenir. Ülkemizde aslında yasaklanmıştır;

2. Genetik materyalin daha önce doğmuş olanın cinsiyet dışı hücrelerine verildiği ve germ hücrelerine iletmediği somatik.

Gen tedavisi canlıda klonlanmış (çoğaltılmış) ve spesifik olarak paketlenmiş DNA dizilerinin hastanın belirli dokularına doğrudan verilmesine dayanır. Gen hastalıklarının in vivo tedavisi için özellikle umut verici olan, aerosol veya enjekte edilebilir aşılar kullanan genlerin tanıtılmasıdır. Aerosol gen tedavisi, kural olarak, akciğer hastalıklarının (kistik fibroz, akciğer kanseri) tedavisi için geliştirilmektedir.

Bir gen terapisi programının geliştirilmesinden önce birçok aşamadan geçilir. Bu, karşılık gelen genin dokuya özgü ifadesinin (yani, belirli bir dokudaki bazı proteinlerin gen matrisi üzerindeki sentez) kapsamlı bir analizini ve birincil biyokimyasal kusurun tanımlanmasını ve yapı, işlev ve çalışmaların incelenmesini içerir. protein ürününün hücre içi dağılımının yanı sıra biyokimyasal analiz patolojik süreç. Uygun tıbbi protokol hazırlanırken tüm bu veriler dikkate alınır.

Gen düzeltme şemaları hazırlarken, transfeksiyon verimliliği, hücre kültürü koşulları altında birincil biyokimyasal kusurun düzeltme derecesi ( laboratuvar ortamında,"in vitro") ve en önemlisi, canlıda hayvan biyolojik modellerinde. Ancak o zaman klinik araştırma programı başlayabilir. .

Terapötik genlerin doğrudan iletimi ve hücresel taşıyıcıları

Yabancı DNA'yı ökaryotik bir hücreye sokmak için birçok yöntem vardır: bazıları fiziksel işlemeye (elektroporasyon, manyetofeksiyon, vb.), diğerleri uygulamaya bağlıdır. kimyasal maddeler veya taşıyıcı olarak kullanılan biyolojik partiküller (örn. virüsler). Kimyasal ve fiziksel yöntemlerin genellikle birleştirildiğini hemen belirtmekte fayda var (örneğin, elektroporasyon + lipozomlarla DNA sarma)

Doğrudan Yöntemler

1. Kimyasal bazlı transfeksiyon birkaç tipte sınıflandırılabilir: siklodekstrin maddesi, polimerler, lipozomlar veya nanopartiküller (kimyasal veya viral işlevsellik ile veya olmadan, yani yüzey modifikasyonu ile).
a) En ucuz yöntemlerden biri kalsiyum fosfat kullanımıdır. DNA'nın hücrelere katılımının etkinliğini 10-100 kat arttırır. DNA, etkili emilimini sağlayan kalsiyum ile güçlü bir kompleks oluşturur. Dezavantajı ise DNA'nın sadece %1-10'unun çekirdeğe ulaşmasıdır. Kullanılan yöntem laboratuvar ortamında DNA'yı insan hücrelerine aktarmak (Şekil 3);

Şekil 3

b) DNA'yı bağlamak ve hücreye aktarmak için yüksek düzeyde dallanmış organik moleküller - dendrimer kullanımı (Şekil 4);

Şekil 4

c) DNA transfeksiyonu için çok etkili bir yöntem, onun lipozomlar -çift lipid tabakası olan hücresel sitoplazmik zar (CPM) ile kaynaşabilen küçük, zarla çevrili gövdeler- yoluyla sokulmasıdır. Ökaryotik hücreler için, katyonik lipozomlarla transfeksiyon daha etkilidir çünkü hücreler onlara daha duyarlıdır. Sürecin kendi adı var - lipofeksiyon. Bu yöntem bugün en güvenli yöntemlerden biri olarak kabul edilir. Lipozomlar toksik değildir ve immünojenik değildir. Bununla birlikte, lipozomları kullanarak gen transferinin etkinliği sınırlıdır, çünkü onlar tarafından hücrelere verilen DNA genellikle lizozomlar tarafından hemen yakalanır ve yok edilir. DNA'nın lipozomların yardımıyla insan hücrelerine sokulması günümüzde tedavinin temel dayanağıdır. canlıda(şek.5);

Şekil 5

d) Diğer bir yöntem, dietilaminoetil-dekstran veya polietilenimin gibi katyonik polimerlerin kullanılmasıdır. Negatif yüklü DNA molekülleri pozitif yüklü polikatyonlara bağlanır ve bu kompleks daha sonra endositoz yoluyla hücreye girer. DEAE-dekstran değişiklikleri fiziksel özellikler plazma zarı ve bu kompleksin hücre tarafından alınmasını uyarır. Yöntemin ana dezavantajı, DEAE-dekstranın yüksek konsantrasyonlar toksik. Yöntem, gen terapisinde dağıtım almamıştır;

e) Histonların ve diğer nükleer proteinlerin yardımıyla. Doğal koşullar altında birçok pozitif yüklü amino asit (Lys, Arg) içeren bu proteinler, uzun bir DNA zincirini nispeten küçük bir hücre çekirdeğine kompakt bir şekilde paketlemeye yardımcı olur.

2. Fiziksel yöntemler:

a) Elektroporasyon çok popüler bir yöntemdir; Hücrelerin yoğun bir elektrik alanına kısa süreli maruz kalmaları nedeniyle membran geçirgenliğinde ani artış sağlanır. Optimal koşullar altında transformantların sayısının hayatta kalan hücrelerin %80'ine ulaşabileceği gösterilmiştir. Şu anda insanlarda kullanılmamaktadır (Şekil 6).

Şekil 6

b) "Hücre sıkma" - 2013 yılında icat edilen bir yöntemdir. Hücre zarını "yumuşak sıkarak" molekülleri hücrelere ulaştırmanıza olanak tanır. Yöntem, harici malzemelere veya elektrik alanlarına bağlı olmadığı için toksisite veya hedefe yanlış isabet olasılığını ortadan kaldırır;

c) Sonoporasyon - yabancı DNA'nın hücre zarındaki gözeneklerin açılmasına neden olan ultrasona maruz bırakılarak hücrelere yapay olarak aktarılması yöntemi;
d) Optik transfeksiyon - yüksek oranda odaklanmış bir lazer kullanılarak zarda (yaklaşık 1 µm çapında) küçük bir deliğin açıldığı bir yöntem;
e) Hidrodinamik transfeksiyon - genetik yapıları, proteinleri vb. iletmek için bir yöntem. kılcal damarlarda ve hücreler arası sıvıda kontrollü bir basınç artışı ile hücre zarlarının geçirgenliğinde kısa süreli bir artışa ve içlerinde geçici gözeneklerin oluşmasına neden olur. Dokuya hızlı enjeksiyon ile gerçekleştirilir, teslimat ise spesifik değildir. İskelet kası için dağıtım verimliliği - %22 ila %60 ;

f) DNA mikroenjeksiyon - ince cam mikrotübüller (d=0.1-0.5 µm) kullanılarak hayvan hücrelerinin çekirdeğine giriş. Dezavantajı, yöntemin karmaşıklığıdır, çekirdeğin veya DNA'nın tahrip olma olasılığı yüksektir; sınırlı sayıda hücre dönüştürülebilir. İnsanlar için kullanılmaz.

3. Parçacıklara dayalı yöntemler.

a) Transfeksiyona doğrudan bir yaklaşım, DNA'nın eylemsiz katılarla (genellikle altın, tungsten) bir nanoparçacık halinde birleştiği ve daha sonra hedef hücrelerin çekirdeklerine yönlendirilen "fışkıran" gen tabancasıdır. Bu yöntem uygulanır laboratuvar ortamında Ve canlıda genlerin, özellikle, örneğin Duchenne kas distrofisi gibi bir hastalıkta kas dokularının hücrelerine sokulması için. Altın parçacıklarının boyutu 1-3 mikrondur (Şekil 7).

Şekil 7

b) Manyetofeksiyon - DNA'yı hedef hücrelere ulaştırmak için manyetizma kuvvetlerini kullanan bir yöntem. İlk olarak, nükleik asitler (NA) manyetik nanopartiküllerle ilişkilendirilir ve daha sonra bir manyetik alanın etkisi altında partiküller hücreye sürülür. Verimlilik neredeyse %100'dür, bariz toksik olmayan not edilir. 10-15 dakika sonra, parçacıklar hücreye kaydedilir - bu, diğer yöntemlerden çok daha hızlıdır.
c) İmpalefection (impalefection; "depolama", sözlük anlamı "damgalama" + "enfeksiyon") - karbon nanotüpler ve nanofiberler gibi nanomateryalleri kullanan bir dağıtım yöntemi. Bu durumda, hücreler tam anlamıyla bir nanofibril yatağı tarafından delinir. "Nano" öneki, çok küçük boyutlarını belirtmek için kullanılır (bir metrenin milyarda biri içinde) (Şekil 8).

Şekil 8

Ayrı olarak, RNA transfeksiyonu gibi bir yöntemi vurgulamaya değer: hücreye DNA değil, RNA molekülleri - protein biyosentezi zincirindeki “ardılları”; aynı zamanda, RNA'yı kısa parçalara bölen özel proteinler aktive edilir - sözde. küçük enterferans yapan RNA (siRNA). Bu fragmanlar diğer proteinlere bağlanır ve sonunda bu, ilgili genlerin hücre tarafından ekspresyonunun inhibisyonuna yol açar. Böylece hücrede şu anda potansiyel olarak yarardan çok zarar veren genlerin hareketini engellemek mümkündür. RNA transfeksiyonu, özellikle onkolojide geniş uygulama alanı bulmuştur.

Plazmit vektörleri kullanılarak gen aktarımının temel ilkeleri göz önünde bulundurulur. Şimdi viral yöntemlerin değerlendirilmesine geçebiliriz. Virüsler, çoğunlukla bir protein kabuğuna sarılmış bir nükleik asit molekülü (DNA veya RNA) olan hücresel olmayan yaşam formlarıdır. Virüsün genetik materyalinden hastalıkların ortaya çıkmasına neden olan tüm dizileri kesersek, virüsün tamamı da başarıyla genimiz için bir “araç” haline getirilebilir.

Bir virüsün aracılık ettiği bir hücreye DNA sokma işlemine denir. transdüksiyon.
Pratikte en yaygın olarak retrovirüsler, adenovirüsler ve adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler) kullanılır. Başlangıç ​​olarak, virüsler arasında transdüksiyon için ideal adayın ne olması gerektiğini anlamaya değer. Kriterler şöyle olmalıdır:

kararlı;
. yani yeterli miktarda DNA içerme kapasitesi;
. hücrenin metabolik yollarıyla ilgili olarak inert;
. doğru - ideal olarak, genomunu konakçı çekirdeğin genomunun belirli bir yerine entegre etmelidir, vb.

Gerçek hayatta, en az birkaç noktayı birleştirmek çok zordur, bu nedenle seçim genellikle her bir vakayı ayrı ayrı ele alırken gerçekleşir (Şekil 9).

Şekil 9

Listelenen en çok kullanılan üç virüsten AAV en güvenli ve aynı zamanda en doğru olanıdır. Neredeyse tek dezavantajı, nispeten küçük kapasiteleridir (yaklaşık 4800 bp), ancak bunun birçok gen için yeterli olduğu ortaya çıkar. .

Yukarıdaki yöntemlere ek olarak, gen tedavisi genellikle hücre tedavisi ile kombinasyon halinde kullanılır: ilk olarak, belirli insan hücrelerinin bir kültürü bir besin ortamına ekilir, ardından gerekli genler bir şekilde hücrelere verilir, hücreler için yetiştirilir. bir süre sonra tekrar konakçı organizmaya nakledilir. Sonuç olarak, hücreler normal özelliklerine dönebilir. Örneğin, insan beyaz kan hücreleri (lökositler) lösemide modifiye edilmiştir (Şekil 10).

Şekil 10

Hücreye girdikten sonra genin kaderi

Genleri nihai hedefe - çekirdeğe daha verimli bir şekilde iletme yetenekleri nedeniyle viral vektörlerle her şey az çok net olduğundan, plazmit vektörünün kaderi üzerinde duracağız.

Bu aşamada, DNA'nın ilk büyük bariyeri - hücrenin sitoplazmik zarını - geçtiğini başardık.

Ayrıca, kılıflı veya kılıfsız diğer maddelerle kombinasyon halinde, elde etmesi gerekir. hücre çekirdeği böylece özel bir enzim - RNA polimeraz - bir DNA şablonu üzerinde bir haberci RNA (mRNA) molekülü sentezler (bu işleme denir transkripsiyon). Ancak bundan sonra mRNA sitoplazmaya girecek, ribozomlarla bir kompleks oluşturacak ve buna göre genetik Kod bir polipeptit sentezlenir - örneğin, belirli bir terapötik işlevi yerine getirmeye başlayacak olan bir vasküler büyüme faktörü (VEGF) (bu durumda, iskemiye yatkın dokuda vasküler dallanma oluşumu sürecini başlatacaktır).

Girilen genlerin istenen hücre tipinde ekspresyonu ile ilgili olarak, bu problem transkripsiyonel düzenleyici elemanların yardımıyla çözülür. Ekspresyonun meydana geldiği doku, genellikle, dokuya özgü bir güçlendiricinin ("geliştirici" dizilim) indüklenebilir olabilen belirli bir promotör (RNA polimerazın sentezini başlattığı nükleotid dizisi) ile kombinasyonu ile belirlenir. . Gen aktivitesinin modüle edilebileceği bilinmektedir. canlıda güçlendiriciler herhangi bir gen ile çalışabildiğinden, vektörlere yalıtkanlar da dahil edilebilir, bu da güçlendiricinin konumundan bağımsız olarak çalışmasına yardımcı olur ve genler arasında fonksiyonel bariyerler gibi davranabilir. Her güçlendirici, protein faktörlerini aktive etmek veya bastırmak için bir dizi bağlanma bölgesi içerir. Destekleyiciler ayrıca gen ekspresyonunun seviyesini de düzenleyebilir. Örneğin metallotiyonein veya sıcaklığa duyarlı promotörler vardır; hormonla çalışan promotörler.

Bir genin ifadesi, genomdaki konumuna bağlıdır. Çoğu durumda, mevcut viral yöntemler sadece bir genin genoma rastgele yerleştirilmesine yol açar. Bu tür bağımlılığı ortadan kaldırmak için, vektörler oluşturulurken, gen, genoma ekleme yerinden bağımsız olarak genin eksprese edilmesine izin veren bilinen nükleotit dizileri ile sağlanır.

Transgen ekspresyonunu düzenlemenin en basit yolu, ona glikoz salınımı veya hipoksi gibi fizyolojik bir sinyale duyarlı bir gösterge promotörü sağlamaktır. Bu tür "endojen" kontrol sistemleri, insülin üretiminin glikoza bağımlı kontrolü gibi bazı durumlarda faydalı olabilir. Daha güvenilir ve çok yönlü, gen ekspresyonu küçük bir ilaç molekülünün eklenmesiyle farmakolojik olarak kontrol edildiğinde "dış kaynaklı" kontrol sistemleridir. Şu anda, 4 ana kontrol sistemi bilinmektedir - tetrasiklin (Tet), bir böcek steroidi, ekdison veya analogları, antiprogestin ilaç maifpriston (RU486) ve rapamisin ve analogları gibi kimyasal dimerizörler tarafından düzenlenir. Bunların tümü, istenen gene öncülük eden ana promotöre transkripsiyon aktivasyon alanının ilaca bağlı alımını içerir, ancak bu alımın mekanizmalarında farklılık gösterir. .

Çözüm

Verilerin gözden geçirilmesi, dünyadaki birçok laboratuvarın çabalarına rağmen, hepsinin zaten bilindiği ve test edildiği sonucuna götürür. canlıda Ve laboratuvar ortamında vektör sistemleri mükemmel olmaktan uzaktır . Yabancı DNA teslimi sorunu varsa laboratuvar ortamında pratik olarak çözüldü ve farklı dokuların hedef hücrelerine teslimi canlıda başarılı bir şekilde çözüldü (esas olarak belirli dokulara özgü antijenler dahil olmak üzere reseptör proteinleri taşıyan yapılar oluşturarak), ardından mevcut vektör sistemlerinin diğer özellikleri - entegrasyon stabilitesi, düzenlenmiş ifade, güvenlik - hala ciddi iyileştirmelere ihtiyaç duyuyor.

Her şeyden önce, entegrasyonun istikrarı ile ilgilidir. Şimdiye kadar genoma entegrasyon sadece retroviral veya adeno-ilişkili vektörler kullanılarak sağlandı. Kararlı entegrasyonun verimliliği, reseptör aracılı sistemler gibi gen yapılarını geliştirerek veya yeterince kararlı epizomal vektörler (yani, çekirdek içinde uzun süreli kalabilen DNA yapıları) yaratılarak arttırılabilir. Son zamanlarda, memeli yapay kromozomlarına dayalı vektörlerin oluşturulmasına özel bir ilgi gösterildi. Sıradan kromozomların temel yapısal elemanlarının mevcudiyeti nedeniyle, bu tür mini kromozomlar hücrelerde uzun süre tutulur ve tam boyutlu (genomik) genleri ve bunların doğru çalışması için gerekli olan doğal düzenleyici elemanlarını taşıyabilir. genin, doğru dokuda ve doğru zamanda

Gen ve hücre tedavisi, kayıp hücre ve dokuların restorasyonu ve organların genetik mühendisliği tasarımı için parlak umutlar açar; bu, şüphesiz biyomedikal araştırma yöntemlerinin cephaneliğini önemli ölçüde genişletecek ve insan yaşamını korumak ve uzatmak için yeni fırsatlar yaratacaktır.

30 Ağustos 2017 Gıda Ürünleri ve İlaç Dairesi (FDA), kan kanseri için dünyanın ilk gen tedavisini onayladı. Bu, Novartis Pharmaceuticals'ın CAR-T teknolojisine dayanan ve diğer tedavilere dirençli veya diğer tedavilere dirençli olan veya 25 yaşına kadar olan çocuklarda ve genç yetişkinlerde B hücreli akut lenfoblastik lösemi tedavisine yönelik Kymriah'dır (tisagenlecleucel). hastalığın nüksetmesi var.

CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisinin kullanımı, gen terapisinde yeni olanaklar sunuyor. CRISPR/Cas9, hücrelerin DNA'sını çok doğru ve güvenli bir şekilde değiştirmenize olanak tanır. Ve CRISPR/Cas9 teknolojisini adeno-ilişkili virüsler kullanarak teslimat ile birleştirirsek, o zaman bu, görünüşe göre, vücut üzerinde sistemik bir etkiye izin verecek ve çok sayıda hücrenin genomunu tamamen güvenli bir şekilde değiştirecektir.

Ve 2016'da Duke Üniversitesi'nden (ABD) genetikçiler, tarihte ilk kez yetişkin bir memelide (fare) gen tedavisini başarılı bir şekilde yürütmeyi ve kas distrofisi ile ilişkili genetik bir hastalığı tedavi etmeyi başardıklarını açıkladılar. Bunun için, karşılaştırmalı olarak değiştirilmiş bir versiyonu yeni teknoloji CRISPR/Cas9 genlerinin düzenlenmesi. CRISPR/Cas9 gen düzenleme teknolojisi, genetik materyalin hedefine iletilmesine yardımcı olmak için adeno-ilişkili bir virüsün kullanılmasını içerir. Bu teknoloji kullanılarak, test tüplerinde ve tek hücreli embriyolarda tek tek hücrelerin genlerini düzenlemek için başarılı deneyler yapılmıştır. Ne yazık ki, şimdiye kadar insan embriyoları üzerinde genetik manipülasyon olasılığı şiddetli bir tartışma konusudur.

CRISPR/Cas tüm beklentileri aştı. Minimum sayıda hatayla hem gerekli genleri "kapatmaya" hem de yeni genleri genomun kesin olarak tanımlanmış bölgelerine entegre etmeye izin verdi.

Aralık 2015'te, Feng Jang'ın araştırma ekibi bu sistemi tamamen hatasız hale gelecek şekilde değiştirdi ve bu, önde gelen dergilerde yayınlandı. bilimsel dergi Bilim. Bilim adamları, Cas9 endonükleazındaki 3 amino asidi (proteini oluşturan yapı taşları) değiştirdiler, ardından böyle bir sistemdeki hataların sayısı neredeyse sıfıra indirildi.

CRISP/Cas9 kullanımı, çoğu vücut hücresinde ortak olan uzun ömür yollarını etkilemenin gerekli olduğu yaşlanmanın gen tedavisi için özellikle önemlidir. 2015 yılına kadar, yaşlanma için gen tedavisi üzerinde hiçbir insan klinik denemesi yapılmamıştı, bu şaşırtıcı değil, çünkü yaşlanma henüz bir hastalık olarak tanınmadı.

Ayrıca yaşlanmaya yönelik gen tedavisi hala çok genç ve gelişmekte olan bir alandır. Şimdi, yaşlanmanın gen tedavisi ile ilgili tüm çalışmalar, model fareler, sıçanlar, maymunlar ve insan hücre kültürleri - in vitro hücreler üzerinde gerçekleştirilmektedir.

Yaşlanmanın gen terapisine yönelik tüm yaklaşımlar, uzun ömürlü genin vücuda verildiği yaklaşımlar ve geni veya yaşlanma yolunu "kapatan" küçük RNA'ların verildiği yaklaşımlar olarak ikiye ayrılır. Yani, ilk durumda, uzun ömür için yararlı bir şey tanıtılır ve ikincisinde zararlı olan kapatılır. Kesin konuşmak gerekirse, 2015 yılına kadar memelilerde yaşlanmaya ilişkin sadece iki gen terapisi çalışması yapılmıştır.

Fazla daha fazla eser transgenik farelerde model gen tedavisi. Bu tür çalışmalarda, tedavi edici gen yetişkin bir farenin vücuduna iletilmez, ancak genetik mühendisliğinin yardımıyla, genomu doğumdan itibaren değiştirilmiş fareler oluşturulur. Gen terapisi gibi, bu da farklı genlerin aktivitesindeki artışın veya azalmanın vücudun ömrünü ve yaşlanmasını nasıl etkilediğini keşfetmenize olanak tanır.

Gen terapisi ve genetik mühendisliğinin teorik olarak yaşlanmayla mücadele etmek için neler yapabileceğine bir göz atalım.

Gen tedavisinin diğer yaşam uzatma yöntemlerine göre avantajı

Bu nedenle, yaşamın uzatılması konusundaki araştırmaları insanlara çevirmekten bahsediyorsak, o zaman gen tedavisi, ihtiyaçtan dolayı yaşam kalitesini düşürmediği için mutlak bir avantaja sahiptir. kalıcı tedavi- günlük bir diyet uygulayın veya sürekli olarak geroprotektörler veya diğer ilaçları kullanın. Ayrıca, gen tedavisi oldukça hedeflidir ve bu nedenle daha az yan etki potansiyeline sahiptir.

Ayrıca, ilaçlarçeşitli doku ve organlarda sınırlı biyoyararlanımı vardır.

İki yaşındaki vahşi tip farelere (insan açısından 40-50 yaş arası) telomeraz (TERT) geninin tek bir enjeksiyonla eklenmesi telomerlerin uzunluğunu arttırır ve ömrünü %20 uzatır.

Bilim adamı, hücrelerde toplam sayılarını sınırlayan belirli bir bölünme sayacı olduğunu öne sürdü. 10 yıl sonra, Rus bilim adamı Alexei Olovnikov, bu sayacın çalışması için varsayımsal bir mekanizma önerdi.

Olovnikov, hücre bölünmesi sırasında telomer adı verilen kromozomların uçlarının hafifçe kısaldığını öne sürdü. Telomerler kritik bir uzunluğa ulaştığında hücre bölünmeyi durdurur ve yaşlanır. Daha sonra, Amerikalı bir sitogenetik bilim adamı olan Elizabeth Helen Blackburn ödüllü oldu Nobel Ödülü 2009'da Fizyoloji veya Tıp'ta Carol Greider ve Jack Szostak ile birlikte, 1971'de Alexei Olovnikov tarafından önerilen bir teoriye göre "kromozomları telomerler ve telomeraz enzimi tarafından korumaya yönelik mekanizmaların keşfi için" ifadesiyle.

Aksine, yaşlanmayan hücrelerde (örneğin, germ ve embriyonik kök hücreler), telomerleri uzatan ve hücrelerin neredeyse süresiz olarak bölünmesine izin veren bir enzim olmalıdır. Ek olarak, telomeraz genindeki hasarın, model hayvanların ömrünü büyük ölçüde kısalttığı ve erken yaşlanma sendromu - progeria'nın başlamasına yol açtığı gösterilmiştir.

Telomerazın keşfinden sonra düzinelerce bilim insanı buna dayanarak yaşlılığa çare bulmaya girişti. Görünüşe göre telomerazın tüm hücrelerde "açılması" vücudu ölümsüz kılabilir. Bununla birlikte, aktif telomeraz sentezinin% 90 oranında gözlemlenmesi nedeniyle kısa sürede korkular ortaya çıktı. kanserli tümörler. Soru ortaya çıktı: telomerazın aktivasyonu malign dönüşüm riskine yol açar mı?

Ek olarak, hücre yaşlanmasına her zaman telomerlerde bir azalmanın eşlik etmediği ortaya çıktı. Örneğin, oral mukozanın epitel hücreleri veya insan gözünün korneası durumunda. Bu, telomeraz aktivasyonunun tek başına tüm vücudu gençleştirmek için yeterli olmayabileceğini düşündürdü. Gen tedavisine geçmeden önce telomerazın etkileri transgenik farelerde incelendi. Tüm fare hücrelerinde TERT genini “açarsanız”, yaşam beklentisinin %40 arttığı ortaya çıktı! Bununla birlikte, telomerazın sürekli aktivitesi de kanser riskini artırdı. Bu nedenle, telomeraz çalışmasının daha kısa bir süre için nasıl etkinleştirileceği sorusu ortaya çıktı.

Günümüzde telomeraz ilaçlarla da uyarılabilmektedir. Bu alanda ilginç bir çalışma, düşük dozlarda valsartan ve fluvastatin ile vasküler gençleştirme üzerine bir dizi başarılı klinik çalışmanın ardından 2016 yılında Ljubljana Üniversitesi'nden (Slovenya) bilim adamları tarafından gerçekleştirildi. Bu sefer 130 hastadan alınan kan örneklerinde damar gençleştirmeden sonra telomeraz aktivitesini ölçtüler.

Bu nedenle, bir aylık bir kurs, telomeraz aktivitesini önemli ölçüde 3,28 kat artırır, bu da endotelyal fonksiyonda (vasküler gençleştirme) bir iyileşme ve kan damarlarındaki iltihaplanmada bir azalma ile önemli ölçüde ilişkilidir. Ve bu yüksek seviye telomeraz devam eder, yavaş yavaş azalır, altı ay daha. Ancak telomerazdaki böyle bir artışın telomerleri ne kadar etkili bir şekilde etkilediği henüz belirlenmemiştir.

Böyle bir terapi doğru zamanda ve çok uzun süre yapılmazsa telomerlerin yaşamlarımızı mutlaka uzatamayacağını bilmek önemlidir.

Ayrıca telomerazın tek başına uyarılması telomerleri uzatmayabilir. Telomeraz aktivitesi yaşla neredeyse değişmez - soldaki grafiğe bakın. Ve telomerler hala küçülüyor.

Ayrıca bugün piyasada telomeraz aktivitesini artıran bir ilaç var - TA-65. Çok pahalı ve yapılan çalışmalarda farelerin ömrü hiçbir şekilde uzamadı. Burada soldaki tabloya bakın. 2011 yılında yapılan bir çalışmada, İspanyol Ulusal Bilim adamları Kanser Merkeziönceki çalışmada olduğu gibi telomerazı artırmak için uzun ömürlü iki yaşındaki farelere TA-65 vermeye başladı. Sadece önceki bir çalışmada, farelere gen tedavisi için enjekte edildi. Ancak TA-65 ilacı, gen terapisinin aksine (soldaki grafiğe bakın) hiçbir şekilde farelerin ömrünü uzatmadı ve ömrü uzatmak ve yaşlanmayı yavaşlatmak için tamamen işe yaramazdı.

2011 yılında, Teksas Üniversitesi'nden bilim adamları, 60'tan fazla memeli türünün hücre kültürlerinde telomer ve telomeraz üzerinde çalıştılar. Telomerlerin uzun ömürlülükteki rolü o kadar açık değildi ... Araştırmalar gösteriyor (yaklaşık 60 memeli türünü karşılaştırırken), bir türdeki telomerler ne kadar uzunsa, DNA mutasyonları o kadar hızlı birikiyor, daha kanserli tümörler ve daha kısa yaşam beklentisi . Telomer uzunluğu, yaşam süresi ile ters orantılıdır. Bu durum, farelerde tek enjeksiyonla elde edilen telomeraz ömrünün uzatılması sonucunun insanların ömrünü uzatmayabileceğini düşündürmektedir. İnsanlar için telomer sorusu açık kalıyor.

Çıktı: Gelecekte, teorik olarak, 40-50 yaşlarında tek bir enjeksiyonla telomeraz geninin (TERT) tanıtılmasıyla telomerlerin uzunluğunu artırabileceğiz, ancak bu tür bir tedavi açıkça tek başına yeterli değil. . En hızlı şekilde, insan ömrünü önemli ölçüde uzatmak için gen terapisi etkilerinin bir kombinasyonunu bulmalıyız. Bugün, bir aylık, altı aylık ilaç kombinasyonu ile etkiyi taklit edebiliriz. valsartan 20 mg + fluvastatin 10-20 mg, veya telmisartan + atorvastatin 10 mg. En azından bu ilaçlar kombinasyon halinde telomerazın kendisini uyarabilir.

Anjiyotensin AT1a reseptörlerini kodlayan Agtr1a geninin bozulması, vahşi tip farelere kıyasla transgenik farelerin ömrünü %26 uzatır.

Kaplan, primat örneğini kullanarak, bir grup erkek primat toplarsanız, birkaç gün içinde maymunların bir sosyal hiyerarşiye sahip olacağını gösterdi. Böyle bir hiyerarşide en kötü yer en alttadır. Alt konumdaki erkek primatlar, bir dizi kronik stres göstergesi gösterir. Genellikle ateroskleroz geliştirirler. Bilim adamları, sosyal hiyerarşinin en altındaki (risk altındaki) erkek primatlara bir beta bloker verdiğinde propranolol sempatik sinir sisteminin aktivitesini baskılayarak, daha sonra vasküler ateroskleroz gelişmedi.

Sempatik sinir sisteminin stres nedeniyle ateroskleroz gelişimini olumsuz etkilediği ve kalp ve kan damarları ile ilgili sorunlara karıştığı ortaya çıktı. Duygusal stres, beynimizin kontrol merkezlerini birbirine bağlayan sempatik (adrenerjik) otonom sinir sistemi aracılığıyla kendini gösterir. iç organlar. Dahil - bağışıklık ile, kemik iliği Ateroskleroz, gelişmiş ülkelerde kalp enfarktüsü ve beyin felcinden en fazla sayıda ölüme yol açan ana faktördür.

Goldstein S ve meslektaşları tarafından düzenlenen 1983 tarihli randomize, çift kör, plasebo kontrollü bir çalışma, tedavinin propranolol Akut miyokard enfarktüslü 3837 hastada kardiyovasküler hastalıklardan ölümleri azaltır (dünyada 1 numaralı ölüm nedeni).

Mart 2017'de Fransız bilim adamları, orak hücre anemisinin tedavisi için gen tedavisinin başarılı klinik denemelerini bildirdiler.

Amerikan Ulusal Bilimler Akademisi ve Ulusal Tıp Akademisi'nden oluşan bir komite, 2017 yılında insan embriyolarının genomunun düzenlenmesi için destek verdi. Ama sadece için ciddi hastalıklar ve sıkı kontrol altındadır.

sonuçlar

1. Yaşlanmanın gen tedavisine yönelik tüm yaklaşımlar, uzun ömür geninin vücuda verildiği ve genin veya yaşlanma yolunun “kapatıldığı” yöntemlere ayrılır.

2. Diğer yaşam uzatma yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, gen tedavisinin ömür boyu sadece bir kez yapılması yeterlidir.

3. Telomeraz geninin (TERT) eklenmesi, Agtr1a geninin bozulması, GHRKO nakavt, IGF-1 reseptörlerini kodlayan genlerde bozulma, FGF21 aşırı ekspresyonu, AC5 nakavt, RIP3 silme, PCSK9 gen düzenleme, Klotho aşırı ekspresyonu, RAGE nakavt, BubR1 üzerinde ifadesi, MTH1 aşırı ifadesinin tümü en çok örnekleridir. etkili yollar hayvanların ömrünü uzatmak için genetik mühendisliği veya gen tedavisi.

4. Yaşlanmanın gen terapisinde ve yaşlanmaya karşı genetik mühendisliğinde daha önemli sonuçlar elde etmek için farklı yaklaşımların birleştirilmesi gerekmektedir. Etiket ekle

Gen tedavisi, hastanın hücrelerine başka genlerin sokulmasıyla gerçekleştirilen kalıtsal, kalıtsal olmayan tedavisidir. Tedavinin amacı, gen kusurlarını ortadan kaldırmak veya hücrelere yeni işlevler kazandırmaktır. Sağlıklı, tam işlevli bir geni bir hücreye sokmak, var olan bir hücredeki kusurları düzeltmekten çok daha kolaydır.

Gen tedavisi somatik dokulardaki çalışmalarla sınırlıdır. Bunun nedeni, cinsiyet ve germ hücrelerine yapılacak herhangi bir müdahalenin tamamen öngörülemeyen bir sonuç vermesidir.

Halihazırda kullanılan teknik, hem monogenik hem de çok faktörlü hastalıkların (malign tümörler, bazı ciddi kardiyovasküler, viral hastalıklar) tedavisinde etkilidir.

Tüm gen terapisi projelerinin yaklaşık %80'i HIV enfeksiyonu ile ilgilidir ve şu anda hemofili B, kistik fibroz, hiperkolesterolemi gibi araştırılmaktadır.

Tedavi şunları içerir:

bireysel hasta hücresi türlerinin izolasyonu ve yayılması;

yabancı genlerin tanıtılması;

yabancı genin "kök aldığı" hücrelerin seçimi;

Bunların hastaya implantasyonu (örneğin, kan nakli yoluyla).

Gen tedavisi, klonlanmış DNA'nın hastanın dokularına verilmesine dayanır. en çok etkili yöntemler buna enjekte edilebilir ve aerosol aşılar dahildir.

Gen tedavisi iki şekilde çalışır:

1. Monogenik hastalıkların tedavisi. Bunlar, nörotransmitter üreten hücrelere verilen herhangi bir hasarla ilişkili beyindeki bozuklukları içerir.

2. Tedavi Bu alanda kullanılan başlıca yaklaşımlar şunlardır:

genetik gelişme bağışıklık hücreleri;

tümör immünreaktivitesinde artış;

onkogen ekspresyon bloğu;

sağlıklı hücrelerin kemoterapiden korunması;

tümör baskılayıcı genlerin tanıtılması;

sağlıklı hücreler tarafından antikanser maddelerin üretimi;

antitümör aşılarının üretimi;

antioksidanların yardımıyla normal dokuların lokal olarak çoğaltılması.

Gen tedavisinin kullanımının birçok avantajı vardır ve bazı durumlarda tek şanstır. normal hayat hasta insanlar için. Ancak, bu bilim alanı tam olarak araştırılmamıştır. Cinsiyet ve implantasyon öncesi germ hücreleri üzerinde test yapılmasına yönelik uluslararası bir yasak vardır. Bu, istenmeyen gen yapılarını ve mutasyonları önlemek için yapılır.

Klinik deneylere izin verilen bazı koşullar geliştirilmiştir ve genel olarak kabul edilmektedir:

Hedef hücrelere aktarılan genin uzun süre aktif olması gerekir.

Yabancı bir ortamda, gen etkinliğini korumalıdır.

Gen transferi vücutta olumsuz reaksiyonlara neden olmamalıdır.

Dünyanın her yerindeki birçok bilim insanı için günümüzde geçerliliğini koruyan birkaç soru var:

Gen tedavisi alanında çalışan bilim adamları, yavrular için tehdit oluşturmayacak eksiksiz bir gen düzeltmesi geliştirebilecekler mi?

Bireysel bir çift için bir gen tedavisi prosedürünün ihtiyacı ve faydası, bu müdahalenin insanlığın geleceğine olan riskinden ağır basacak mı?

Gelecek düşünüldüğünde, benzer prosedürler haklı mı?

İnsanlar üzerindeki bu tür prosedürler, biyosferin ve toplumun homeostazıyla ilgili sorularla nasıl ilişkilendirilecek?

Sonuç olarak, mevcut aşamadaki genetik terapinin, insanlığa en çok tedavi etmenin yollarını sunduğu belirtilebilir. ciddi hastalıklar yakın zamana kadar tedavi edilemez ve ölümcül kabul edilen. Ancak aynı zamanda bu bilimin gelişmesi, bilim adamları için bugün ele alınması gereken yeni sorunlar ortaya çıkarmaktadır.